Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

1. Sıçanlar Koku Mukoza Koleksiyonu Temiz bir kültür kaput DMEM / HAM F12 kültür ortamı ile dolu üç adet 35 mm Petri kapları hazırlayarak başlayın. Herhangi bir ötenazi yöntemi kurumun hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından önceden onaylanmış ve kalifiye personel tarafından yürütülen olmalıdır. Sıçan gibi ketamin / xylazine anestezi sodyum pentobarbital veya diğer enjektabl formları ile derin anestezi girdikten sonra, başını kesmek ve cilt çıkarın. Uçucu anestezikler kaçınılmalıdır. Anestezi yeterliliği dekapitasyon önce ayak tutam tarafından değerlendirilecektir. Makas ile alt çene çıkarın ve bir rongeur yardımı ile, her iki tarafta da yüz kasları yok. Dişlerin arkasından başlayarak, bir rongeur nazal kavite, bir defada bir tarafı kaplayan kemik çıkarın. Turuncu / kahverengi organları burun arkasında bulunan koku alma konkalar görüş haline gelir. İncelikli bir forseps ile konkalar atın. Dik plaka, kribriform plaka ve burun boşluğunun tavan ark: 26 iğne kullanarak, üç satır boyunca doku keserek septum yatarken koku mukozası izole. Her iki tarafta biyopsileri toplayın ve bir DMEM / HAM F12 dolu Petri kabı aktarabilirsiniz. Bu prosedür, başlangıcından ötenazi itibaren 10 dakikadan daha uzun sürmemelidir. Şimdi, mukus ortadan kaldırmak amacıyla, orta dolu Petri kutularına biyopsileri iki kez transfer. 2. İnsanlar Koku Mukoza Koleksiyonu Bu prosedür, ilgili yerel etik kurul (lar) uygun bir Kulak Burun Boğaz (KBB) cerrah tarafından gerçekleştirilen olmalı, ve her ayaktan bilgilendirilmiş onam formu imzalamanız gerekir. 0 ° veya 30 ° rijit endoskop (4 mm çapında) kullanarak, her iki burun boşlukları varsayılan polip ya da herhangi bir inflamatuar lezyon varlığı incelemek ve değerlendirmek. Septum sapma dikkate alarak, en iyi nazal kavite seçin. Bir pamuk aplikatör kullanarak, 10 dakika boyunca, adrenalin, lidokain gibi lokal anestezi uygulanır. Throughcut etmoid forseps ile orta konka medial kök veya dorsomedial alanda septum ya bir iki milimetre kare biyopsi toplamak. Olfaktör biyopsi sonra 1 ml DMEM / HAM F12 ile dolu 2 ml steril bir tüp içine, steril bir iğne kullanılarak aktarılır. Ters tüp İpucu biyopsi kültür ortamında dalmış olduğundan emin olun. Buzdolabında bir kap içinde tüp takın ve araştırma laboratuvarı taşıma. Bu aşamada, biyopsi karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için özel beyin hastalıkları odaklanmış veya kök hücre üretmek için işlenen tek başına kullanılabilir. 3. İnsan ve Rat Mukoza Koku Kök Hücre İzolasyonu DMEM / HAM F12 biyopsileri yıkayın. 37 1 saat için 1 ml dispase II çözeltisi (2.4 IU / ml) ile dolu bir Petri kabındaki biyopsileri inkübe ° C Sonra, bir Kırınan ters ışık ile bir diseksiyon mikroskobu altında, mikro spatula kullanarak temel lamina propria olfaktör epitel kaldırılır. Olfaktör epitel çizgili olan lamina propria ile karşılaştırıldığında daha ince ve siyah arka plan üzerine yarı saydam görünen turuncu / kahverengi. Beyaz bir arka plan üzerinde, epitel ve lamina propria, kahverengi, gri görünüyor. Saflaştırılmış sonra, lamina propria DMEM / HAM F12 ile dolu bir Petri kabı içine aktarın. Doku kemirgen ise, lamina propria, iki adet 25 gauge iğne ile küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, 1 ml kollajenaz IA ile dolu bir 15 ml tüp parçaları aktarın. Tüp içinde, steril bir plastik pipet kullanarak, doku ayrıştırmaları. Sonra az 10 dakika, 37 tüp inkübe ° C Ayrışma sonlandırmak için tüp hafifçe rock ve 9, Ca-özgür ve Mg-free PBS ml ve 5 dakika boyunca 200 g santrifüj ekleyin. Plastik kültür kaplarına% 10 fetal sığır serumu, antibiyotik ve plaka ile desteklenmiş DMEM / HAM F12 kültür ortamı içinde hücre pelletini tekrar. Şimdi, doku, insan ise, sonra 200 ila 500 mikron arasında değişen, kalınlığı 3 ila 4 adet lamina propria dilim. Kendi 2 cm çapında kültür çanak içine her şerit yerleştirin ve steril 1.3 cm çapında cam kapak fişleri ile doku kapağı. Sonra, her kültürün çanak kültür ortamı ul 500 (% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik ile desteklenmiş DMEM / HAM F12) ekleyin. Ya da doku tipi için, her 2 ila 3 gün kültür ortamı yenilemek. Beş ila yedi gün sonra, kök hücre kültürü çanak işgal etmeye başlayacak ve iki hafta sonra konfluent olmalıdır. , Geçiş ulaştı ve kültür şişeler hücrelere transfer olduğunda confluency. 4. Küre Oluşumu ve Nöronal differeKoku Kök Hücreler, ntiation Kök hücre küre oluşturmak için, 37 şişeler az iki saat inkübe ° C poli-L-lisin. (METİN: 5 g/cm2). Tedavi şişeler santimetre kare başına 16.000 hücre yoğunluğu hücreleri Plaka. Her iki günde tamamlanan orta santimetrekare başına 0.2ml (DMEM / HAM F12, insülin, transferrin, selenyum (ITS-X,% 1), EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (takviye ile hücreleri beslemek, 50 ng / ml)). Iki ila beş gün sonra, kayan hücre küre ve ya yeniden plakalı toplamak veya hücre tedavisi hayvan modelleri aşılama önce onları ayrıştırmaları. Nöron-benzeri hücreler içine koku alma kök hücrelerin ayırt etmek için, B-27, penisilin, streptomisin, glutamin ve glutamat içeren Neurobasal ortamda 21 gün için onları yetiştirmek. Daha sonra her 3 günde bir orta değişiklikler yapmak. Nöron benzeri hücreler 2-3 hafta sonra görünmelidir. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Burun insan eksplant outgrowing kök hücreler (Şekil 2A) hızlı bölünen ve confluency 1-2 hafta içinde ulaşılabilir. Stemness, bir anahtar özelliği, nestin ifade değerlendirildi (Şekil 2B). EGF (50 ng / ml) ve FGF2 (50 ng / ml) ile desteklenmiş bir serum serbest kültür ortamı ile poli-L-lizin büyüdüğü zaman, koku kök hücreler küre (Şekil 2C) neden olmaktadır. Serum içeren kültür ortamında yetişen yeni kaplama küre GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (Rakamlar ortaya çıkmasına neden 2D-F). Ancak, küre-kökenli hücreler kaderi değiştirilebilir. Örneğin, B27 ve glutamat, β-III tubulin (Şekil 2G) ve map2 (Şekil 2H) ifade nöron-benzeri hücreler içine burun koku kök hücrelerin çoğu ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında büyüdü. Şekil 1, deney Genel şeması . Olfaktör mukoza biyopsileri, sıçan ve insan nazal kavite eksize. Eksplantlarındaki beyin hastalıkları biyobelirteçleri belirlenmesine yönelik karşılaştırmalı moleküler çalışmalar için başlı başına kullanılabilir. Lamina propria ve nöro-epitel arasındaki etkileşimler, koku alma kök hücreleri izole etmek için, 45 dakika sonra, bir mikro-spatula ile epitel kaldırılır dispase II enzim bozulur ve. Kemirgen koku alma kök hücreler daha kollajenaz IA ile lamina propria dissociating tarafından seçilir. Outgrowing kök hücrelerin bütün istila kadar insan doku, koku alma lamina propria adet cam lamel altında kültüre. Çoğalması sonra, uygun bir kültür ortamı kullanılarak, koku kök hücreler küre üretebilir veya nöron hücrelerine ayırt. Olfaktör kök hücreler için kullanılabilir) onarım beyin hastalıkları ya da travma veya ii) merkezi sinir sistemi hastalıkları moleküler belirteçleri tespit. Çizimler Servier Tıp Sanat yardımı ile yapılır. Şekil 2, burun, insan koku alma kök hücreleri Kültür ve farklılaşma . Serum içeren ortamda yetiştirilen lamina propria eksplant (A) büyüyen insan kök hücreleri, hızla bölünerek. Kök hücreler, stemness işaretleyici nestin (B) ifade eder. Poli-L-lisin kaplı plastik kaplama ve EGF ve FGF2 ile desteklenen bir serum serbest kültür ortamında yetiştirilen, koku kök hücreler küre (C) oluşturur. Küre kökenli hücrelerin, serum içeren kültür ortamında kaplama, doğuran GFAP-ifade hücreleri (~% 50), tubulin ifade hücreleri (~% 10-15) ve O4 ifade hücreleri (~% 2-5) 9 (DF). B27 ve glutamat ile desteklenmiş bir Neurobasal kültür ortamında yetişen, β-III tubulin (G) ve map2 (H) ifade nöron-benzeri hücrelere farklılaşırlar.