Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung
Summary
Anwendungs-und direkte Messungen von Kräften auf Neuronen im 2-1000 Microdyne Bereich sind mit hoher Genauigkeit kalibriert Glasnadeln erreicht. Diese Methode kann verwendet werden zur Steuerung und Messung verschiedene Aspekte der axonalen Entwicklung, einschließlich der axonalen Initiierung, axonale Spannung, Geschwindigkeit der axonalen Dehnung und Kraftvektoren werden.
Abstract
Handy-Manipulationen und die Erweiterung der neuronalen Axone können mit kalibrierten Glas Mikro-Fasern für die Messung und Anwendung von Kräften in 10-1000 μdyne Bereich 1,2 erreicht werden. Kraftmessung durch Beobachtung des Hookeschen Biegen des Glases Nadeln, die durch eine direkte und empirische Methode 3 kalibrierten erhalten. Anforderungen an die Ausrüstung und Verfahren für die Herstellung, Eichung, Behandlung und Verwendung der Nadeln auf Zellen sind vollständig beschrieben. Die Kraft Regime bisher verwendeten und verschiedene Zelltypen, zu denen diese Techniken angewendet wurden demonstrieren die Flexibilität der Methode und dienen als Beispiele für zukünftige Untersuchungen 4-6 gegeben. Die technischen Vorteile sind die kontinuierliche "Visualisierung" der Kräfte, die durch die Manipulationen produziert und die Möglichkeit, direkt in eine Vielzahl von zellulären Geschehen einzugreifen. Dazu zählen direkte Stimulation und Regulation des axonalen Wachstums-und Ausfahren 7; sowie Ablösung und mechanische Messungen auf jeder Art von kultivierten Zellen 8.
Protocol
Discussion
Techniken anzuwenden und zu messen zellulärer Kräfte haben eine lange Geschichte 9. Unsere Methode wurde ursprünglich durch die Arbeit von Dennis Bray, der Glas-Nadeln ähnlich wie bei uns zu "schleppen" Neuronen mit einer konstanten Rate über einen motorisierten hydraulische Vorrichtung 10 verwendet motiviert. Es gibt viele alternative Mittel zur Anwendung Kräfte auf Zellen, die zählen: Schrittmotoren 11, magnetische Kügelchen 12, mikrofabrizierten Balken <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns für die wichtigen Beiträge von Dr. Robert E. Buxbaum in der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
Referências
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