Механические Манипуляция Нейроны для управления аксонального развития
Summary
Применение и прямых измерений сил на нейроны в диапазоне 2-1000 microdyne достигаются с высокой точностью с использованием калиброванных иглы стекла. Эта методика может быть использована для контроля и измерения ряда аспектов аксонального развития, в том числе аксонального инициации, аксонального напряжение, скорость аксонального удлинения и векторов сил.
Abstract
Сотовые манипуляций и расширение нейронных аксонов может быть выполнена с калиброванный стеклянный микро-волокна, способный измерять и применения силы в диапазоне 10-1000 1,2 μdyne. Группы измерений получены через наблюдение Hookean изгиб стекла игл, которые калибруются по прямой и эмпирический метод 3. Требования к оборудованию и процедурам для изготовления, калибровки, обработки и использования игл на клетки полностью описаны. Силу режимов ранее использовались и различные типы клеток, в которой эти методы были применены продемонстрировать гибкость методологии и приводятся в качестве примеров для будущего расследования 4-6. Технические преимущества непрерывной "визуализации" из сил, создаваемых манипуляций и возможность непосредственно вмешиваться в различных клеточных событий. К ним относятся прямой стимуляции и регулирования рост аксонов и втягивание 7; а также отряд и механических измерений на любом типе культурной ячейке 8.
Protocol
Discussion
Методы применения и меру сотовой силы имеют давнюю историю 9. Наш метод первоначально был мотивирован работой Деннис Брей, которые использовали стеклянные иглы похожи на наши, чтобы "буксире" нейронов при постоянной скорости использованием моторизованных гидравлические ус…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем искреннюю благодарность важный вклад д-ра Роберта Э. Буксбаум в развитии этой методологии.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
Referências
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
