РНК-интерференция в клещи

1. Генерация дсРНК. Синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих последовательности T7 промотор для транскрипции в пробирке и синтез дсРНК (например, для Dermacentor variabilis subolesin использованием олигонуклеотидных праймеров D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'и D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). Amplify гена-мишени ОТ-ПЦР, используя 10 пмоль каждого праймера и олигонуклеотида 1-10 нг РНК тик общего количества. Purify продукта ПЦР. Обобщить дсРНК использовании 8 мкл продукта ПЦР очищенная. Количественная дсРНК по-спектрометрии. 2. Инъекция тики с дсРНК. 2.1. Подготовка клещей для инъекций. Во-первых, мыть клещей в серии решений, встряхивая их в каждом решении в 50 мл одноразовые трубки центрифуги, разливая раствор через мелкое сито проволочной сетки по трубке сверху сохранить клещей. Последовательность решений для мытья клещей водопроводной воды, 3% перекись водорода, два моет дистиллированной воды, 70% этанола и еще два моет дистиллированной водой. Пятно сухой клещей на бумажных полотенцах. Граф клещей на группы от 20 до 50, в зависимости от эксперимента, место клещей из каждой группы в 1,25 пластиковом стакане г с подогнаны крышки и этикетки с экспериментальными номер группы. 2.2. Тик инъекции команды. Команда RNAi состоит из трех человек: (1) один человек, который позиции каждого тика на двойной клейкой ленты прикреплены к листу красной зубных слепков, (2) один человек, который вводит клещей и (3) один человек, который следит за клещей после инъекции, дышит CO 2 на клещей, чтобы активировать их и подсчитывает жизни клещей в чашки помечены экспериментальные номер группы. Все члены команды должны носить одноразовые перчатки. 2.3. Размещение клещей для инъекций. Захват тик использованием Дюмон штраф пинцетом и поместить его брюшной стороне на двойной клейкой ленты прикреплены к 3 "х 6" лист красной стоматологического воска. Клещей близко расположены вместе в группы по 5 клещей. Место небольшую полоску клейкой ленты на ротовых всех 5 тиков в целях дальнейшего удержать их, но, оставляя большую часть тела подвергается, так что инъекции процесс можно наблюдать тик инжектора (рис. 1). 2.4. Инъекция клещей. Тиков будет введен в правом нижнем квадранте брюшной поверхности экзоскелет. Во-первых, пробить отверстие в экзоскелет с помощью шприца Monoject инсулина оснащены ½ ", 29 иглы (рис. 2а). Inject клещей сразу же с 0,2-0,5 мкл раствора дсРНК (5 х 10 10 – 5 х 10 11 молекул в мкл) с использованием заказных Гамильтон шприц с 1 дюйм, 33 иглы с 45 ° скошенной точке (рис. 2б) . Иглы должны быть размещены также в тик полости, чтобы обеспечить размещение и хранение дсРНК. Некоторые жидкости, скорее всего, побег из места инъекции (рис. 2в). Следует проявлять осторожность, чтобы не вводить в течение клещей, которые будут вызывать потерю гемолимфы и может привести к гибели клеща. Чистая шприца Гамильтона после окончания инъекций в каждой экспериментальной группы. Перед использованием для другой экспериментальной группе. Заполните шприц сначала из стакана, содержащий 3% перекиси водорода, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Заполните шприц из стакан, содержащий стерильной водой, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Будьте осторожны, чтобы не погнуть поршень шприца Гамильтона, потому что, если изогнуты, поршень не будет двигаться плавно и реагировать на нежные прикосновения, необходимых для введения клещей. 2.5. Лечение клещей после инъекции. Возьмите вводят непосредственно из тика двойной клейкой ленты с тонким пинцетом и поместить его в пластиковый контейнер восстановления (примерно 6 "х 6" и кольчатой ​​с клейкой лентой, чтобы предотвратить побег клещи). Клещи будут кратко неактивные после инъекции, но в ближайшее время должен начать ползать блюдо. Дыхание CO 2 на клещей сразу же после помещения их в контейнер для восстановления помочь активировать клещей. Как только клещи ползут и активным, инъекции рана будет заживать быстрее, и они, скорее всего, выжить. Граф клещей в зависимости от количества в каждой экспериментальной группы и поместите их в пластиковый стаканчик помечены с подогнаны крышкой. Замена клещей должен быть введен, чтобы заменить какой-либо, что любой умер перед инъекцией следующего экспериментальной группе. 2.6. Тик холдинга. Место клещей в камере влажности (12hr свет: 12 ч темно фотопериода на 22-25 ° С и 95% относительной чumidity) и удерживайте в течение 1 дня. Место клещей в тик-питание клеток, по одному в экспериментальной группе, приклеены к овцам и дать им возможность кормиться с равным количеством uninjected мужчина или женщина клещей (в зависимости от пола не вводили). Женский клещи, которые питаются в сытости, те, которые удаляются из овец через 10 дней после кормления или когда контроль самок высадили хост собираются и взвешиваются. Место клещей в картонных коробках, и держать в камере влажности до окончания яйцекладки. Оценка откладки яиц путем взвешивания яичная масса производимого всеми клещей в группе. 2.7. Анализ клеща фенотипа после RNAi. Оценка тик фенотипа после кормления, определяя количество тактов, которые выжили, отметьте вес, откладки яиц и яичных плодородия. Тем не менее, другие анализы могут быть выполнены в зависимости от целевого гена и задачи исследования. 3. Анализ для подтверждения генов ОТ-ПЦР. Рассеките слюнных желез и кишки от отдельных клещей из-под контроля впрыска и дсРНК впрыском групп после кормления. Извлечение общей РНК из отдельных образцов ткани. Анализ стенограмм гена-мишени в отдельных тканей в режиме реального времени RT-PCR и нормализовать уровни РНК против клещевого 16S рРНК использованием genNorm метод (метод ddCT как осуществляется Bio-Rad iQ5 Standard Edition, версия 2.0). Выполнить диссоциации кривых в конце реакции, чтобы только один ампликона формируется и что ампликонов денатурировать последовательно в том же диапазоне температур для каждого образца. Сравнить уровни мРНК (нормированные значения Ct) между контролем впрыском и дсРНК впрыском клещей использованием Студенческие т-тест (р = 0,05). 4. Представитель Результаты: Протокол, описанный в этом документе, были использованы в нашей лаборатории для RNAi в самых разных видов иксодовых тики (табл. 1). Количество дсРНК вводят клещей зависит от размера тика; больше видов клещей может вместить больший объем. Отрицательные клещей контроль должен быть введен с несвязанными дсРНК. Несколько dsRNAs таких как subolesin 14-19,22-25,27-32,34 и бета-актин 20,21 можно использовать в качестве положительного контроля. Обратите внимание, что очень важно, чтобы вымыть шприц между курсами лечения, чтобы избежать смешивания растворов дсРНК. Если протокол будет сделано правильно, менее чем на 5% смертности должны быть получены из процедуры инъекции через 24 часа. Типичный фенотип гена после нокдауна в тактах показано на рисунке 3 с панели клещи вводят пулов дсРНК для того, чтобы показать на экране для клещ защитных антигенов. Тик видов дсРНК вводили Ссылки Ixodes scapularis кДНК библиотеки, subolesin, актин, нуклеотидазы, NF-Кб, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, убиквитин, vATPase, селенопротеинов M и W2A, гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток белка, как, актин протеасомы 26S субъединицы, ferritin1, varisin, akirin 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum кДНК библиотеки, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus шпеиз Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus MicroPlus GST, убиквитин, селенопротеина, Bm86, Bm91, subolesin Г.И., GIII, EF1a, жгутовидные шелковые белка, фон Виллебранда фактор 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus аппиШиз убиквитин, subolesin, EF1a, GIII 16 Таблица 1. Tick видов, в которых РНК-интерференции протокол был использован. Рисунок 1. Размещение клещей, вентральной стороной вверх, на двойной клейкой лентой придерживался лист красной стоматологического воска. Клещей помещаются в группы по 5, после чего небольшую полоску клейкой ленты находится над ротовые в целях дальнейшего безопасного клещей, позволяя наблюдать инжектор тело клеща во время инъекции. Рисунок 2. Инъекции процедура включает в себя (а) пирсинг правом нижнем квадранте тик экзоскелет с инсулином сиRinge оснащен 29 иглу, чтобы создать месте инъекции, (б) немедленное введение дсРНК на этом сайте, используя шприц Гамильтон с 33 иглы которых (с), скорее всего, приведет к некоторой утечке клещей гемолимфы / жидкости. Рисунок 3. Панели клещей шесть групп, в которых РНК-интерференции был использован для выявления тик защитных антигенов в Amblyomma americanum. Фенотипические изменения у клещей можно увидеть при сравнении с положительным subolesin RNAi контроля и отрицательных связанных контроль дсРНК. В этом эксперименте влияние RNAi в кредит смертности, веса и откладки яиц в каждой группе было статистически проанализированы.