El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera
Summary
Este protocolo de vídeo se muestra la aplicación de la prueba neuroesfera para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales de las eminencias ganglionares del día embrionario 14 de cerebro de ratón.
Abstract
En los mamíferos, las células madre actúa como una fuente de células indiferenciadas para mantener génesis y renovación celular en diferentes tejidos y órganos durante el ciclo de vida del animal. Que potencialmente pueden reemplazar las células que se pierden en el proceso de envejecimiento o en el proceso de lesiones y enfermedades. La existencia de células madre neurales (NSC) fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss (1992) en los mamíferos adultos del sistema nervioso central (SNC) utilizando un nuevo sistema de suero libre de la cultura, el ensayo neuroesfera (NSA). El uso de este ensayo, también es posible aislar y expandir NSCs de diferentes regiones del sistema nervioso central embrionario. Estos in vitro NSCs ampliado son multipotentes y pueden dar lugar a los tres principales tipos de células del sistema nervioso central. Mientras que la NSA parece relativamente simple de realizar, la atención a los procedimientos demostrado aquí se requiere a fin de lograr resultados confiables y consistentes. Este video demuestra prácticamente la NSA para generar y ampliar NSCs a partir del día 14 embrionario del ratón tejido cerebral y ofrece detalles técnicos por lo que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la recolección de embriones de ratón E14, microdisección del cerebro para recoger las eminencias ganglionares, la disociación de los tejidos recolectados en el medio de NSC para obtener una suspensión de células individuales, y, finalmente, placas células en cultivo NSA. Después de 5-7 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes se pasan a ampliar aún más el número de la NSCs para futuros experimentos.
Protocol
Discussion
El ensayo neuroesfera es el método de elección para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales 1-5 debido a su sencillez y reproducibilidad. Este ensayo es una herramienta invaluable para generación a gran escala de células precursoras indiferenciadas del SNC, que podrían ser utilizados para los estudios in vitro e de vivo. Cabe destacar que neuroesferas podrían ser generados por la bona fide las células madre neuronales y progenitores más restringido. Por…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Referências
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
