Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal
Summary
Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.
Abstract
As pontas móveis de axônios em crescimento são chamados cones de crescimento. Cones de crescimento levam a navegar axônios através dos tecidos em desenvolvimento, interagindo com pistas expressas localmente orientação molecular que se ligam receptores cone de crescimento e regulam a dinâmica e organização do citoesqueleto cone de crescimento 3-6. O principal alvo desses sinais de navegação é a malha filamento de actina que enche a periferia cone de crescimento e que dirige a motilidade cone de crescimento através da polimerização de actina contínua e dinâmica remodelação 7. Pistas de orientação positiva ou atraentes induzir cone de crescimento transformando estimulando actina filamento (F-actina) polimerização na região da periferia do cone de crescimento que é mais perto da fonte do cue atrativo. Esta polimerização de actina unidades locais de crescimento cone protrusão de adesão, da margem de liderança e alongamento axonal em direção ao atrativo.
Polimerização de actina filamento depende da disponibilidade de monômero de actina suficiente e nos núcleos de polimerização ou termina filamento de actina farpado para a adição de monômero. Actina monômero é abundantemente disponível no pinto gânglio da raiz dorsal e da retina (DRG) cones de crescimento. Conseqüentemente, a polimerização aumenta rapidamente quando livre F-actina termina farpado ficam disponíveis para a adição de monômero. Isso ocorre no pinto DRG e cones da retina de crescimento através da ativação local da actina proteína F-actina cortando depolymerizing fator (ADF / cofilina) na região cone de crescimento mais perto de uma 80-10 atrativo. Esta atividade ADF / cofilina heightened severs filamentos de actina para criar novos F-actina termina farpado para polimerização. O método a seguir demonstra esse mecanismo. Conteúdo total de F-actina é visualizado através da coloração com phalloidin fluorescente. F-actina termina farpado são visualizados através da incorporação de rodamina-actina dentro de cones de crescimento que são permeabilizadas com o procedimento descrito a seguir, que é adaptado a partir de estudos anteriores de outras células móveis 11, 12. Quando rodamina-actina é adicionado em uma concentração acima da concentração crítica para além de monômero de actina para fins farpado, rodamina-actina monta para livre termina farpado. Se a sugestão atraente é apresentado em um gradiente, como sendo liberados a partir de uma micropipeta posicionada para um lado de um cone de crescimento, a incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado será maior no lado cone de crescimento para a micropipeta 10 .
Cones de crescimento são estruturas celulares pequenas e delicadas. Os procedimentos de permeabilização rodamina-actina fixação incorporação, e visualização de fluorescência são cuidadosamente feito e pode ser realizada no palco de um microscópio invertido. Estes métodos podem ser aplicados ao estudo de polimerização de actina locais nos neurônios migrar, outras células do tecido primário ou linhas celulares.
Protocol
Discussion
Os métodos aqui apresentados permitem resolução temporal e espacial de componentes celulares que estão envolvidos na remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina na margem líder de migração cones de crescimento. A ação das moléculas de atrativo, como NGF ou netrin, para estimular rapidamente a polimerização de actina filamento é revelado como um aumento local na actina termina farpado, criado por actina cortando filamento ativado ADF / cofilina 10, como mostrado nas Figuras 1 e 2. O método…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. James Bamburg e membros de seu laboratório para a colaboração nestes estudos. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH HD19950, EY07133 e por concessões do Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
Referências
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