Testmetoder Yta Redovisning av Chemosensory Receptorer i heterologa Cells
Summary
Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.
Abstract
Den levande värld av lukter är erkänd av känslan av luktsinne. Lukten i möss förmedlas av en repertoar av ca 1200 g Tillsammans proteinkopplade receptorer (GPCRs) 1 som postulerade att binda flyktiga doftämnen och omvandla den extracellulära signalen till en intracellulär signal genom koppling med G-protein Gαolf. Bindning av odörer till receptorer tros följa en kombinatorisk regel, det vill säga får en luktämnen binda flera receptorer och en receptor kan binda flera luktämnen i varierande grad 2. Biokemiska, signal-och ligandbindande studier har praktiskt genomförts för de flesta GPCRs med heterologt celler. Men användningen av heterolog celler för studier av luktreceptorer var utesluten för länge sedan på transfektion de misslyckades med att exportera till ytan. Saito et al har visat enda Receptor membranet passerar transporterande protein (RTP) familj följeslagare visar förbättrade uttryck i lukt sensoriska neuroner och agera som följeslagare till receptorer trafiken luktämnen till ytan i heterologa celler, vid samtidig transfekterade ihop 3. Att utföra biokemiska analyser för receptorer med heterologa celler, måste man först avgöra om receptorn uppvisar en robust yta uttryck i cellinje. Detta kan analyseras genom att överuttryck av receptorer med förkläde RTP1S följt av levande celler färgning till fluorescerande etikett den extracellulära domänen eller en tagg i den extracellulära domänen exklusivt. Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.
Protocol
Discussion
Varje steg måste utföras försiktigt för att säkerställa framträdande och särskiljande ytan färgning. Hela färgning processen måste utföras i kallt (på is), och facket som täckglas läggs måste kylas före användning för att säkerställa celler överleva. Dessutom fixering sker i slutet av ytan fläckar processen. Detta står i skarp kontrast med intern färgning där fixering före färgning till permeabilize cellmembranet till primära och sekundära antikroppar. Tiden för exponering av täckglas til…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar ledamöterna Matsunami laboratorium för kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
Referências
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
