Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B
Summary
Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in un<em> Ex vivo</emCultura> splenica di linfociti B è descritto. Questo metodo si avvale della produzione retrovirali ricombinanti in un libero helper, ecotrophic linea cellulare di packaging. Stabile, ereditari espressione di un gene di interesse all'interno di linfociti primario è raggiunto porta alla generazione di anticorpi di superficie sulle cellule B in fase interruttore ricombinazione classe.
Abstract
L'espressione transgenica di geni nelle cellule eucariotiche è un potente approccio inverso genetica in cui è espresso un gene di interesse sotto il controllo di un sistema di espressione eterologo per facilitare l'analisi del fenotipo risultante. Questo approccio può essere utilizzato per esprimere un gene che non si trova normalmente nell'organismo, per esprimere una forma mutante di un prodotto del gene, oppure a un eccesso di esprimere un dominante negativo forma del prodotto genico. E 'particolarmente utile nello studio del sistema ematopoietiche, dove regolazione trascrizionale è un meccanismo di controllo importante nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule B 1, recensione in 2-4.
Genetica del topo è un potente strumento per lo studio dei geni e delle patologie umane. Un'analisi comparativa del mouse e genoma umano rivela conservazione delle synteny in oltre il 90% del genoma 5. Inoltre, gran parte della tecnologia utilizzata in modelli murini è applicabile allo studio dei geni umani, per esempio, le interruzioni dei geni e la sostituzione allelica 6 . Tuttavia, la creazione di un topo transgenico richiede una grande quantità di risorse sia di natura tecnica e finanziaria. Diversi progetti hanno cominciato a compilare le librerie di ceppi di topi knock out (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagenesi indotta da ceppi (RIKEN), che richiedono grandi sforzi e la collaborazione 7. Pertanto, è auspicabile primo studio il fenotipo di un gene desiderato in un modello di coltura cellulare di cellule primarie prima di passare a un modello murino.
DNA retrovirale integra nel DNA ospite, preferibilmente all'interno o in prossimità di unità di trascrizione o isole CpG, con conseguente stabile e ereditabile espressione del gene di interesse confezionato evitando silenziamento trascrizionale 8 9. I geni sono poi trascritti sotto il controllo di un promotore retrovirali ad alta efficienza, con una conseguente alta efficienza di trascrizione e produzione di proteine. Pertanto, l'espressione retrovirali possono essere utilizzati con le cellule di difficile trasfezione, a condizione che le cellule sono in uno stato attivo durante la mitosi. Perché i geni strutturali del virus sono contenuti all'interno della linea cellulare di packaging, i vettori di espressione utilizzata per clonare il gene di interesse non contengono geni strutturali del virus, che sia elimina la possibilità di revertanti virale e aumenta la sicurezza di lavorare con surnatanti virale come non virioni infettivi vengono prodotti 10.
Qui vi presentiamo un protocollo per la produzione ricombinante retrovirali e successiva infezione delle cellule B della milza. Dopo l'isolamento, le cellule coltivate splenica sono stimolati con Th linfochine derivati e anti-CD40, che induce una raffica di proliferazione e differenziazione delle cellule B 11. Questo protocollo è l'ideale per lo studio di eventi che si verificano in ritardo nello sviluppo delle cellule B e la differenziazione, le cellule B sono isolate dalla milza seguenti iniziale eventi ematopoietiche, ma prima di stimolazione antigenica per indurre la differenziazione plasmocitaria.
Protocol
Discussion
Trasduzione retrovirale delle cellule B della milza, come descritto qui e come illustrato nella figura 1 è un approccio genetico che è utile nello studio dei linfociti B, perché molti degli eventi di sviluppo in lymphopoesis sono controllati da regolazione trascrizionale 1, 2. Negli ultimi stadi di maturazione delle cellule B, innescando via CD40L è essenziale per l'induzione della crescita delle cellule B, l'ingresso nel ciclo cellulare e la proliferazione 11, 20. Come…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK è supportato dal programma Columbia University Graduate. UB è Fellow della Leukemia and Lymphoma Society of America, il destinatario del Premio New Investigator dalla Fondazione per la Ricerca leucemia ed è supportato da Facoltà Columbia University di New start-up fondi.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Referências
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