Här beskriver vi ett protokoll för isolering och odling av murina pulmonell endotelceller. Denna metod består av mekaniker och enzymatiska lungvävnad dissociation samt en 2-stegs reningsprocess med hjälp av anti-PECAM-1 och anti-ICAM-2 antikroppar konjugerade till magnetiska kulor, vilket ger en ren endotelceller befolkning mestadels mikrovaskulära ursprung.
Endotelceller en användbar forskning modell i många områden i vaskulär biologi. Sedan den första isolering 1, har mänskliga navelsträngen ven endotelceller (HUVECs) visat sig vara praktiskt, lätt att få och kultur, och därmed är det mest studerade endotelceller. Men för forskning fokuserad på processer som angiogenes, genomsläpplighet eller många andra, mikrovaskulära endotelceller (EC) är en mycket mer fysiologiskt relevant modell för att studera 2. Dessutom EC isolerad från knockoutmöss ge ett användbart verktyg för analys av proteiners funktion ex vivo. Flera metoder för att isolera och kultur mikrovaskulära EC av olika ursprung har hittills rapporterats 3-7, men konsekvent isolering och odling av ren EC är fortfarande ett stort tekniskt problem i många laboratorier. Här ger vi en steg för steg protokoll om en tillförlitlig och relativt enkel metod för att isolera och odla musen lung endotelceller (MLECs). I denna strategi, lungvävnad från 6 – till 8-dagar gamla ungar är först i bitar, kokas med kollagenas / dispase (C / D) lösning och spridda mekaniskt till encelliga suspension. MLECS är renade från cellsuspension använda positiv selektion med anti-PECAM-1-antikropp konjugerat till Dynabeads hjälp av en magnetisk Particle Concentrator (MPC). Sådana renade celler odlas på gelatin-belagd vävnadsodling (TC) rätter tills de blir sammanhängande. Vid det tillfället är celler renas ytterligare med Dynabeads kopplat till anti-ICAM-2 antikroppar. MLECs erhålls med detta protokoll uppvisar en kullersten fenotyp, som visualiseras genom faskontrast ljusmikroskopi, och deras endotel fenotyp har bekräftats med hjälp av FACS analys med anti-VE-cadherin 8 och anti-VEGFR2 9 antikroppar och immunofluorescens färgning av VE-cadherin. I våra händer, detta i två steg Isoleringsförfarande konsekvent och tillförlitligt ger en ren population av MLECs, vilket ytterligare kan odlas. Denna metod kommer att ge forskarna möjlighet att dra nytta av det växande antalet knockout och transgena möss att direkt korrelera in vivo-studier med resultat av in vitro-experiment som utförs på isolerade MLECs och därmed bidra till att avslöja molekylära mekanismer av vaskulära fenotyper observerats in vivo.
Mikrovaskulära EC har visat sig vara en användbar modell i många områden i vaskulär biologi och tros vara mer fysiologiskt relevanta för studien (t.ex. angiogenes) än studerats ingående HUVECs 3. Tidigare har det rapporterats att mikrovaskulära EC kan erhållas från njure, hjärta, hud, näthinnan, hjärnan, gliom, fettvävnad och lunga 2, 4-7, 10, 11. Det är dock en konsekvent och tillförlitlig metod för isolering av mikrovaskulära EC fortfarande. Förfarandet som presenteras här är en modifiering av ett tidigare publicerade protokoll 2, det skiljer sig från de flesta publicerade förfaranden som den använder ungar istället för vuxna djur. Detta är avgörande för isolering framgång som celler från unga djur har en högre spridning potential och kulturer från sina vävnader tenderar att ge högre antal celler. En vecka gamla djur verkar vara optimalt, men yngre möss (4 dagsgamla) kan också användas. Dessutom kan högre eller lägre antal valpar användas om det krävs, som vi har lyckats isolera MLECs från en valp. Men medan trappa upp eller ner i isoleringen processen måste cellen plätering täthet förblir oförändrade, eftersom detta också är avgörande för celltillväxt. Den 2-stegs reningsprocess för MLECs med magnetiska kulor konjugerat första som anti-PECAM-1 och än mot ICAM-2-antikroppar är mycket mer effektiva på att få rena EG kulturer än den tidigare beskrivna ett steg rening förfaranden. Detta protokoll eliminerar behovet av att använda mycket mödosamma manuella tekniker, gradient centrifugering och mindre effektiva FACS sortering för kassering förorena celler såsom fibroblaster, blodkroppar och smidig muskelceller. Den resulterande MLEC befolkningen kan användas för in vitro-analys av angiogena svar, vaskulär permeabilitet och leukocyt transmigration, sårläkning samt biokemisk analys av signalsystem. Vid behov kan MLECs beläggas på olika ytor som fibronektin eller gelatin-belagd täckglas för immunofluorescens eller elektrod arrayer för trans-endotelceller motstånd (TER) mätningar. Uppnådda resultaten direkt kan jämföras med fenotyper observerats in vivo, vilket är särskilt viktigt mot bakgrund av det växande antalet knockout och transgena linjer mus. Framgångsrikt genomförande av denna metod för in vitro-analys av cellulära mekanismer underliggande defekter observerats in vivo, har redan lagts fram 12.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds delvis av American Heart Association bevilja 0950118G.to MC-W.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |