هنا ، نحن تصف بروتوكول للثقافة العزلة والفئران من خلايا بطانة الأوعية الدموية الرئوية. يضم هذا الأسلوب ميكانيكي والأنزيمية تفارق أنسجة الرئة ، فضلا عن عملية تنقية 2 – خطوة استخدام الألغام المضادة للPECAM – 1 ومعاداة ICAM – 2 الأضداد مترافق إلى حبات المغناطيسي ، والتي تنتج الخلايا البطانية نقية السكان من أصل الاوعية الدموية الدقيقة في معظمها.
الخلايا البطانية تقديم نموذج بحث مفيد في كثير من مجالات البيولوجيا الوعائية. منذ عزلتها الأول (1) ، وقد أظهرت خلايا بطانة الوريد السري (HUVECs) لتكون مريحة وسهلة للحصول على والثقافة ، وبالتالي هي أكثر الخلايا البطانية درس على نطاق واسع. ومع ذلك ، للبحث تركز على عمليات مثل الآخرين الأوعية الدموية والنفاذية أو كثيرة ، الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (ECS) هي نموذج أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لدراسة 2. علاوة على ذلك ، ECS المعزولة من الفئران خروج المغلوب توفير أداة مفيدة لتحليل وظيفة البروتين فيفو السابقين. العديد من الطرق لعزل والاوعية الدموية الدقيقة ECS ثقافة المنشأ مختلفة تم الإبلاغ عنها حتى الآن 3-7 ، ولكن العزلة تتفق وثقافة نقية ECS لا يزال يمثل مشكلة رئيسية في العديد من المختبرات التقنية. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة على طريقة موثوقة وبسيطة نسبيا من عزل وزراعة الخلايا البطانية الرئة الماوس (MLECs). في هذا النهج ، وأنسجة الرئة التي تم الحصول عليها من 6 — 8 ليوم هو أول خفض الجراء القديم إربا ، يتفاعل مع كولاجيناز / dispase (C / D) الحل وفرقت ميكانيكيا في وحيدة الخلية تعليق. ويجري تنقية MLECS من الايقاف الخلية باستخدام اختيار الإيجابي مع مضادات الأجسام المضادة PECAM – 1 مترافق لاستخدام المكثف Dynabeads الجسيمات المغناطيسية (MPC). يتم استزراع هذه الخلايا على تنقيته زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين (TC) الأطباق حتى تصبح متموجة. عند هذه النقطة ، كذلك تنقية الخلايا باستخدام Dynabeads بالإضافة إلى مكافحة ICAM – 2 الأضداد. MLECs حصل مع هذا البروتوكول يحمل النمط الظاهري حصوه ، كما تصور المجهري ضوء التخلص النقيض من ذلك ، وتأكدت من النمط الظاهري البطانية FACS باستخدام التحليل المضادة للكادهيرين VE – 8 و 9 VEGFR2 المضادة للأضداد وتلطيخ مناعي من كادهيرين – VE. في أيدينا ، وهذا إجراء العزل من خطوتين باستمرار وبشكل موثوق تعطي السكان نقية من MLECs ، والتي يمكن أيضا مثقف. وهذه الطريقة تمكن الباحثين من الاستفادة من عدد متزايد من خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا لربط مباشرة في الدراسات المجراة مع نتائج التجارب في المختبر أجريت على MLECs معزولة وبالتالي يساعد في الكشف عن الآليات الجزيئية لاحظ الأنماط الظاهرية الأوعية الدموية في الجسم الحي.
وقد أثبتت ECS الاوعية الدموية الدقيقة ليكون نموذجا مفيدا في كثير من مجالات البيولوجيا الوعائية ويعتقد أن يكون أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية للدراسة (مثل الأوعية الدموية) من HUVECs درس على نطاق واسع 3. سابقا ، وقد ذكرت أنه يمكن الحصول عليها من الاوعية الدموية الدقيقة ECS والكلى القلب والأنسجة الدهنية الجلد ، وشبكية العين والدماغ والاورام الدبقية ، وكذلك سرطان الرئة 2 ، 4-7 ، 10 ، 11. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة طريقة متسقة وموثوق بها لعزل ECS الاوعية الدموية الدقيقة. الإجراء المعروض هنا هو تعديل للبروتوكول تنطبق 2 ؛ فهو يختلف عن معظم الإجراءات التي نشرت في أنه يستخدم بدلا من الجراء الحيوانات البالغة. هذا أمر بالغ الأهمية لنجاح العزلة والخلايا من الحيوانات الصغيرة لديها أعلى احتمال انتشار والثقافات المستمدة من أنسجتها ، تميل إلى العائد أعلى عدد من الخلايا. الحيوانات أسبوع واحد من العمر ويبدو أن أمثل ، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا الفئران الأصغر (4 أيام من العمر) يكون. أيضا ، يمكن أن يستخدم هذا الرقم أعلى أو أقل من الجراء إذا لزم الأمر ، كما أننا نجحنا في عزل MLECs من الجرو. ومع ذلك ، في حين أن التوسع صعودا أو هبوطا في عملية العزلة ، ويجب أن الخلية كثافة الطلاء لم تتغير ، وهذا أمر بالغ الأهمية أيضا لتكاثر الخلايا. عملية تنقية 2 – خطوة من MLECs باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق أول 1 – PECAM ومكافحة الألغام المضادة للICAM – 2 الأضداد هو أكثر فاعلية في الحصول على الثقافات الأوروبية نقية من الإجراءات المذكورة سابقا تنقية خطوة واحدة. هذا البروتوكول يلغي الحاجة إلى استخدام التقنيات اليدوية شاقة جدا ، والطرد المركزي والتدرج FACS أقل كفاءة الفرز للخلايا نبذ تلويث مثل الخلايا الليفية ، وخلايا الدم وخلايا العضلات الملساء. ويمكن استخدام السكان الناجمة عن MLEC في التحليل المعملي للردود عائية ، نفاذية الأوعية الدموية والتهجير الكريات البيض ، التئام الجروح ، فضلا عن تحليل الإشارات البيوكيميائية الممرات. إذا لزم الأمر ، يمكن مطلي MLECs على الأسطح المختلفة مثل الجيلاتين coverslips فبرونيكتين أو المغلفة للصفائف المناعي أو العابرة للقطب البطاني القياسات (TER) المقاومة. ويمكن مقارنة النتائج المتحصل عليها مباشرة إلى الظواهر التي لوحظت في الجسم الحي ، وهو أمر مهم لا سيما في سياق العدد المتزايد من خروج المغلوب وخطوط الفأر المعدل وراثيا. وقد تم بالفعل تنفيذ الناجح لهذا الأسلوب في التحليل المختبري من الآليات الخلوية الكامنة العيوب التي لوحظت في الجسم الحي ، قدم 12.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث في جزء من القلب الأميركية 0950118G.to منح رابطة MC – W.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |