Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi
Summary
Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di<em> Salmonella</em> Usando fluorescenza<em> In situ</em> Ibridazione (FISH).
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo semplice per nastro adesivo a base di campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da su-nastro ibridazione in situ fluorescente (FISH) per una rapida indipendente dalla cultura di rilevamento di Salmonella spp. Nastri Cell-paga può anche essere posizionato a faccia in giù su agar selettivo per fase solida arricchimento prima rilevazione. In alternativa, a basso volume arricchimenti liquido (miniculture superficie liquida) può essere effettuata sulla superficie del nastro in brodo non selettivo, seguito da FISH e analisi mediante citometria a flusso. Per iniziare, nastro adesivo sterile è portato a contatto con prodotti freschi, una leggera pressione viene applicata, e il nastro viene rimosso, fisicamente estrazione microbi presenti su queste superfici. I nastri sono montati appiccicosa rivolta verso l'alto su vetrini da microscopio in vetro e le cellule campionate sono fissati con formalina al 10% (30 min) e disidratati attraverso una serie graduata di etanolo (50, 80, e il 95%; 3 minuti per ogni concentrazione). Successivamente, cellule carica nastri sono macchiati con tampone contenente un cocktail mirato Salmonella sonda di DNA e ibridato per 15 – 30 min a 55 ° C, seguita da un breve risciacquo in un buffer di lavaggio per rimuovere la sonda non legata. Aderente, PESCE-etichettati cellule sono poi di contrasto con il DNA colorante 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed i risultati sono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Per la fase solida arricchimento, la cella a carica nastri sono disposti a faccia in giù su una superficie adatta agar selettivi e incubate per consentire la crescita in situ di microcolonie Salmonella, seguita dalla FISH e microscopia come descritto sopra. Per miniculture superficie del liquido, la cella a carica nastri sono disposti lato adesivo e una camera di perfusione di silicone viene applicato in modo che il nastro e far scorrere forma microscopio il fondo di una camera a tenuta stagna in cui un piccolo volume (≤ 500 mL) di Trypticase soia Broth (TSB) è introdotto. I condotti di aspirazione sono sigillati e le camere sono incubate a 35 – 37 ° C, permettendo una crescita a base di amplificazione del nastro estratto microbi. Dopo l'incubazione, condotti di aspirazione sono sigillate, le cellule si staccano e mescolato con schiena vigorosa e indietro pipettaggio, raccolte tramite centrifugazione e fissato nel 10% formalina tamponata neutra. Infine, i campioni sono ibridate e esaminati attraverso la citometria a flusso per rivelare la presenza di Salmonella spp. Come descritto qui, il nostro approccio "nastro-FISH" in grado di fornire campionamento semplice e rapida e la rilevazione di Salmonella sulle superfici di pomodoro. Abbiamo inoltre usato questo metodo per il campionamento di altri tipi di prodotti freschi, tra cui spinaci e peperoni jalapeño.
Protocol
Discussion
Metodi semplici e rapidi per l'individuazione di agenti patogeni sulle superfici producono possono contribuire a mitigare le malattie di origine alimentare, fornendo dati tempestivi e fruibili. Nastro adesivo a base di metodi di campionamento sono stati utilizzati in termini ambientali, cliniche e microbiologia degli alimenti fin dal 1950 e coinvolgono pressione del tipo "Scotch" nastro alle superfici per la rimozione dei microrganismi, seguito dal diretto esame microscopico o il trasferimento di microrgan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Grow Fondo Iowa premio Valori da BFBS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
Referências
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