Summary

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

Published: October 18, 2010
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Summary

このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明して<em>サルモネラ</em>蛍光を使用して<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション(FISH)。

Abstract

このプロトコルは、 サルモネラの迅速なカルチャに依存しない検出のためのin situハイブリダイゼーション(FISH) オンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。また、少量の液体富化(液面のminiculture)はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン%(30分)と段階的エタノールシリーズを用いて脱水(50、80、および95%、3分ごとの濃度)で固定されています。次に、細胞に帯電したテープは、 サルモネラをターゲットとしたDNAプローブのカクテルを含むバッファーでスポットし、15でハイブリダイズさせる- 55℃で30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。接着、FISH -標識細胞は、蛍光顕微鏡を使用して表示しているDNA色素4',6 -ジアミジノ-2 – フェニルインドール(DAPI)との結果で対比されています。固相濃縮するために、細胞に帯電したテープは、適当な選択寒天の表面に直接フェースダウン配置され、 サルモネラ microcoloniesのその場成長許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積(≤500μL)ブロス(TSB)が導入されています。入口ポートは封印されており、チャンバーを35℃でインキュベートされる – 37 ° C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10%で固定されている中性緩衝ホルマリン。最後に、サンプルをハイブリダイズし、 サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。ここで説明したように、私たちの"テープ- FISH"のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。

Protocol

1。滅菌粘着テープで表面のサンプリングサンプリングに使用するテープを選択します。市販のカビ – テープまたはCON -タクト – それはサンプリングのテープは、使いやすさのための滅菌と特別にパッケージされている。しかし、我々は、透明(光学的に透明な)一般的なオフィスのテープも使用できることを見出した。 粘着テープの10cmの部分(紙のテンプレートを使用するこ…

Discussion

農産物表面の病原体の検出のための簡単​​かつ迅速な方法は、タイムリーで実用的なデータを提供することにより、食品媒介疾患の軽減に役立つことがあります。粘着テープベースのサンプリング方法は1950年代から、環境への臨床的および食品微生物学で使用され、直接顕微鏡検査またはのための固体培地に付着した微生物の移転に続いて、微生物の除去のために表面に"スコッチ"…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業のための資金はBFBSに成長アイオワ値基金賞によって提供されていました。

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Fungi-Tape sampling tape   Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape   Birko Corporation, Denver, CO   http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic   Various suppliers   Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface   Local grocery   Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth   Difco, Sparks, MD 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base   Difco, Sparks, MD 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement   Difco, Sparks, MD 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes   Various suppliers   RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA    
NaCl solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes   Integrated DNA Technologies, Coralville, IA   5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge   Various suppliers   Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber   Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station   Various suppliers   Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)   Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope   Various suppliers   Leitz Laborlux S used here
Digital camera   Various suppliers   Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software   Various suppliers   Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop   Adobe Inc.   For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer   Various suppliers   FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software   Various suppliers   FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

Referências

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Citar este artigo
Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

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