Summary

Erkennung von Neu1 Sialidase-Aktivität bei der Regulierung der Toll-like-Rezeptor-Aktivierung

Published: September 07, 2010
doi:

Summary

Die Sialidase-Test ist eine einfache technische Ansatz, der neuartige molekulare Mechanismus (s) der TLR-Sensoren von mikrobiellen Infektionen und die Beteiligung an entzündlichen Erkrankungen an der Rezeptor-Ebene auf der Zelloberfläche von Live-Makrophagen aufzuklären wird.

Abstract

Mammalian Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind eine Familie von Rezeptoren, die pathogen-associated molecular patterns zu erkennen. Nicht nur, dass TLRs entscheidende Sensoren mikrobieller (zB Viren, Bakterien und Parasiten) Infektionen, sie spielen auch eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von Infektionskrankheiten, entzündliche Erkrankungen und möglicherweise bei Autoimmunkrankheiten. So muss die Intensität und Dauer der TLR-Reaktionen gegen Infektionskrankheiten streng kontrolliert werden. Daraus folgt, dass das Verständnis der strukturellen Integrität von Sensor-Rezeptoren, deren Liganden-Wechselwirkungen und Signalisierung Komponenten ist für die nachfolgenden immunologischen Schutz unerlässlich. Es wäre auch wichtig, Möglichkeiten für Krankheit Änderung durch den Sensor Manipulation. Obwohl die Signalwege der TLR-Sensoren sind gut charakterisiert, die Steuerung der Parameter Wechselwirkungen zwischen den Sensoren und deren Liganden immer noch schlecht definiert. Wir haben vor kurzem einen neuen Mechanismus der TLR-Aktivierung durch seine natürlichen Liganden, die nicht zuvor 1,2 beobachtet identifiziert. Er schlägt vor, Liganden-induzierte TLR-Aktivierung ist eng mit Neu1 Sialidase Aktivierung gesteuert. Wir haben auch berichtet, dass Neu1 dicht reguliert Neurotrophinrezeptoren wie TrkA und TrkB 3, die Neu1 und Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk im Komplex mit dem Rezeptor 4 einzubeziehen. Die Sialidase Assay wurde zunächst verwenden, um einen neuen Liganden, thymoquinone zu finden, bei der Aktivierung von Neu4 Sialidase auf der Zelloberfläche von Makrophagen, dendritischen Zellen und Fibroblasten über GPCR Gαi Proteine ​​und MMP-9 5. Für TLR-Rezeptoren zeigen unsere Daten, dass Neu1 Sialidase bereits im Komplex mit TLR-2, -3 und -4 Rezeptoren, und ist bei der Ligandenbindung entweder Rezeptor induziert. Aktiviert Neu1 Sialidase hydrolysiert Sialyl α-2 ,3-verknüpften β-Galactosylresten entfernt von Ligandenbindung an sterische Hinderung an TLR-4 Dimerisierung, MyD88/TLR4 komplexen Rekrutierung, NFkB-Aktivierung und pro-inflammatorischen Zell-Antworten zu entfernen. In einer gemeinsamen Berichts hat Neu1 Sialidase wurde gezeigt, dass die Phagozytose in Makrophagen Zellen 6 zu regeln. Zusammengenommen hat die Sialidase Assay uns mit leistungsfähigen Einblicke in die molekularen Mechanismen von Liganden-induzierte Rezeptor-Aktivierung zur Verfügung gestellt. Obwohl die genaue Beziehung zwischen Neu1 Sialidase und die Aktivierung von TLR hat Trk-Rezeptoren noch nicht vollständig geklärt werden, wäre es eine neue oder bahnbrechende Ansatz Zellregulation Wege darstellen.

Protocol

1. Resurrecting Gefrorene Makrophagen Vor Wiederbelebung eingefrorenen Zellen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, muss man Kulturmedium Verwendung sterilfiltriert Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 5 g / ml plasmocin ergänzt vorzubereiten. Plasmocin ist eine Antibiotika-Lösung in unsere Forschung zur Beseitigung und Vermeidung von Mykoplasmen-Kontaminationen von Zellkulturen. Für ein Fläschchen von gefrorenen Zellen gibt man 4 mL, 1 mL der kultivierten…

Discussion

Mit dem neu entwickelten Assay Sialidase-Aktivität in lebenden Makrophagen 2 zu erfassen, haben wir diese Technologie, um Sialidase-Aktivität in Liganden-induzierter Sialidase-Aktivität zu erkennen in Live-BMC-2 Makrophagen in einer dosisabhängigen Weise sowie in Live-DC-2.4 dendritischen Zellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 Mamma-Adenokarzinom-Zellen, menschliche WT und 1140F01 und WG0544 Typ I Sialidose Fibroblasten. Neuraminidase-Hemmer wie Tamiflu (Oseltamivir Phosphat) gehemmt thymoquinone-induzierte S…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Teilweise Unterstützung durch Zuschüsse zu MRS ist von Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), die Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC, und die Garfield Kelly Cardiovascular Research und Development Fund. SRA ist ein Empfänger der Queens University Research Award und dem Robert J. Wilson Fellowship. PJ ist ein Empfänger der Königin Graduate Award und dem Robert J. Wilson Fellowship. AG und SA werden die Empfänger der Königin Graduate Award. SF war der Empfänger der Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology (OGSST). AG ist der Empfänger der Königin Franklin Bracken Graduate Scholarship. SA ist der Empfänger der Königin RS McLaughlin Graduate Scholarship.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
DMEM   Gibco, Rockville, MD    
4-MUNANA   Biosynth International Inc., Itasca, IL, USA    
Fetal calf serum   HyClone, Logan, Utah, USA    
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media   DAKO North America, Inc., Carpintenia, CA S3023 15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)   Hoffman La Roche    

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Citar este artigo
Amith, S. R., Jayanth, P., Finlay, T., Franchuk, S., Gilmour, A., Abdulkhalek, S., Szewczuk, M. R. Detection of Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation. J. Vis. Exp. (43), e2142, doi:10.3791/2142 (2010).

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