Wir zeigen, ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf Dissektion Nervenfaszikel und Inkubation in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonaler Strukturen, die durch Extraktion der restlichen Axon-angereichertem Material gefolgt basiert.
Abstract
Isolierung von reinem axonalen Zytoplasma (Axoplasma) von peripheren Nerven ist entscheidend für biochemische Untersuchungen von vielen biologischen Prozessen. In diesem Artikel zeigen wir, und beschreiben Sie ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf den folgenden Schritten: (1) Zerlegung der Nervenfaszikel und Trennung von Bindegewebe, (2) Inkubation von kurzen Segmenten Nervenfaszikel in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonalen Strukturen, und (3) Extraktion der verbleibenden Axon-angereichertem Material. Proteomik und biochemische Charakterisierung dieser Zubereitung hat einen hohen Grad der Anreicherung für axonale Komponenten bestätigt.
Protocol
Dieses Protokoll ermöglicht Axoplasma Isolation mit der Minimierung der Glia-und Gefäßgewebe Kontamination. Die Methode liefert etwa 70-100 ug Gesamt Axoplasma Protein pro 8-10 Wochen alte Wistar-Ratte. 1. Dissect Ischiasnerven Euthanize zwei Ratten durch CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte. Bestätigen Tod durch Palpation wegen fehlender Herzschlag vor Beginn der Dissektion. Swab der Präparation mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Haut, sepa…
Discussion
Biochemische und Proteom-Analysen haben bestätigt, dass dieses Verfahren Serum und Gliazellen Verschmutzungsgrad 3 reduziert wie zuvor beschriebenen Verfahren zur Isolierung Axoplasma durch mechanische Squeeze 1 verglichen. Wir haben diese Axoplasma Isolation Protokoll verwendet, um Dynein-basierte retrograde Signalisierung nach Ischiasnerv Verletzung 2 zu erforschen, und erwarten, dass es Nutzen in der Erforschung von vielen anderen Prozessen in der Erwachsenenbildung peripheren Nerven…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Male Wistar rats (8-10 weeks old)
PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
Eppendorfs for 1.5 ml
Sterilized plastic dishes 35 mm
Dissecting tools including: scissors and fine forceps
Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve.Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).