Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato
Summary
Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.
Abstract
Isolamento do citoplasma axonal puro (axoplasma) de nervo periférico é fundamental para estudos bioquímicos de muitos processos biológicos. Neste artigo, vamos demonstrar e descrever um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base nas seguintes etapas: (1) dissecção dos fascículos do nervo e separação do tecido conjuntivo, (2) de incubação de pequenos segmentos de fascículos nervosos em meio hipotônico a liberação de mielina e lise não-axonal estruturas, e (3) extração do material axônio enriquecido restantes. Caracterização proteômica e bioquímica desta preparação confirmou um alto grau de enriquecimento para componentes axonal.
Protocol
Discussion
Análises bioquímicas e proteômica confirmaram que este procedimento reduz a contaminação de células gliais soro e 3 em relação aos métodos descritos anteriormente para o isolamento por axoplasma espremer mecânica 1. Nós temos usado esse protocolo de isolamento axoplasma para explorar dineína baseado sinalização retrógrada após a lesão do nervo ciático 2, e esperar que ela tenha utilidade na exploração de muitos outros processos no nervo periférico de adultos, incluin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Male Wistar rats (8-10 weeks old)
- PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
- Eppendorfs for 1.5 ml
- Sterilized plastic dishes 35 mm
- Dissecting tools including: scissors and fine forceps
- Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
Referências
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