אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.
Abstract
בידוד של הציטופלסמה axonal טהור (axoplasm) מתוך עצב היקפי הוא קריטי עבור מחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנחנו מדגימים ולתאר פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגרים המבוססת על הצעדים הבאים: (1) דיסקציה של fascicles עצב והפרדה של רקמות החיבור, (2) הדגירה של קטעים קצרים של fascicles העצב בינוני hypotonic לשחרר את המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים; ו (3) מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים. אפיון proteomic וביוכימיות של הכנה זו אישרה רמה גבוהה של העשרת עבור רכיבים axonal.
Protocol
פרוטוקול זה מאפשר בידוד axoplasm עם צמצום של זיהום גליה רקמות וכלי דם. השיטה מניבה כ 70-100 axoplasm סך מיקרוגרם חלבון לכל one 8-10 חולדה הישנה שבוע Wistar. 1. לנתח עצבים sciatic להרדים שני עכברושים משאי…
Discussion
מנתח ביוכימיים ו proteomic אישרו כי הליך זה מפחית את זיהום תא בסרום גליה 3 לעומת השיטות שתוארו בעבר על ידי בידוד axoplasm לסחוט מכני 1. השתמשנו בפרוטוקול זה בידוד axoplasm לחקור dynein מבוססי איתות מדרדר לאחר פגיעה עצבית sciatic 2, מצפה שיהיה השירות בחקר של תהליכים רבים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Male Wistar rats (8-10 weeks old)
PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
Eppendorfs for 1.5 ml
Sterilized plastic dishes 35 mm
Dissecting tools including: scissors and fine forceps
Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve.Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).