장기 조절 매체: 전이성 암 연구를 위한 수확된 기관 세포에서 매체를 생성합니다

1. 폐 및 뇌 조절 형 미디어 세대

1. 멸균 조직 배양 후드에서 폐 또는 뇌를 포함하는 PBS 튜브를 세 번 반전하여 장기에서 잔류 혈액을 제거하고 혈액을 포함하는 PBS를 흡인시합니다. 혈액의 증거없이 해결책이 명확 해로 나타날 때까지 신선한 감기 PBS로 반복하십시오.
2. 폐와 뇌를 별도의 60mm2 유리 페트리 접시에 놓습니다. 두 개의 멸균 메스 블레이드를 사용 하 여, 조직 조각에 대 한 ~ 1 mm3 크기때까지 앞뒤로 반복적으로 슬라이스 하 여 폐 또는 두뇌를 다진.
3. 계산된 체중 차이에서 조직 단편을 다시 중단하는 데 필요한 매체의 양을 결정합니다.
   참고: 폐와 뇌 조직은 4:1 media:조직 비(vol/wt)에서 재서스펜션에 의해 정규화된 체중이다.
4. Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)의 적절한 부피 (이전에 결정 된 1.3 단계에서 이전에 결정됨)의 조직 조각을 재중단하십시오 : F12 배지는 1배 농축 된 미토겐 보충제와 페니실린 (50 μg/ml)/연쇄 절제술 (50 μg/ml)으로 보충됩니다.
5. 6웰 플레이트의 한 웰에 다시 매달린 폐 또는 뇌 조직 조각을 추가합니다.
6. 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 미디어에서 조직 조각을 배양합니다. 인큐베이션에 따라 각 조직에 대해 조절된 미디어를 수집하고 50ml 원문 튜브에 3개의 상응하는 양의 신선한 미디어를 추가하여 희석합니다.
7. 원심분리기는 15분 동안 각 장기에 대해 희석된 컨디셔닝 된 매체에서 1,000 x g에서 큰 조직 파편을 제거합니다. 0.22 μm 주사기 필터를 통해 미디어 상응을 수집하고 필터링합니다.
8. 풀은 마우스 대 마우스 가변성을 설명하기 위해 여러 마우스에서 각 기관(즉,뇌가 있는 폐 및 두뇌를 가진 폐)에서 중재된 매체를 고려합니다. Aliquot 및 사용 전까지 -80°C에 조건부 미디어를 저장합니다.