Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlama Yöntemi
Published: April 30, 2023
Abstract
Kaynak: Du, L., vd. Genom Düzenleme ile Drosophila’da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Üretmek için Verimli Bir Strateji. J. Vis. Exp. (2018).
Bu videoda, genomu CRISPR-Cas9 kullanılarak değiştirilen transgenik Drosophila sineklerini tanımlamak için bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. CRISPR-Cas9, bilim adamlarının bir organizmanın genomunu manipüle etme biçiminde devrim yapan güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Örnek protokolde, bir transaktivasyon dizisinin eklenmesinin dalsız (bnl) genin ilk eksonunun yerini aldığı CRISPR tarafından oluşturulan mutantların nasıl tanımlanacağını göreceğiz, böylece bnl gene özgü bir sürücü hattı olan bnl-LexA.
Protocol
Bu protokol, Genom Düzenleme, J. Vis. Exp. (2018) tarafından Drosophila’da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Üretmek için Etkili Bir Strateji olan Du ve ark.’danbir alıntıdır. 1. Sinek genetiği ve taraması (Şekil 1 ve Şekil 2) Enjekte edilen embriyolar yetişkinlere dönüştüğünde, dengeleyici sineklere her bir G0 sinekini geçin. Hedeflenen aleleyi içeren kromozom için uygun dengeleyiciyi seçin. Her G0 ç…
Representative Results
Şekil 1: İkili transkripsiyon sistemi oluşturmak için CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme iş akışına genel bakış. Her adım için gereken yaklaşık süre belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Figure 2" class="xfigim…
Materials
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologia Molecular |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologia Molecular |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologia Molecular |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologia Molecular |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologia Molecular |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologia Molecular |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
Citar este artigo
Screening for Genomic Modifications: A Method to Identify CRISPR-Generated Mutants in Drosophila. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20110, doi: (2023).