Mätning av 50% Hemolytisk Komplement (CH 50) Aktivitet av serum
Summary
Den klassiska vägen aktiveras av antikroppar och kulminerar i mål cellslys. CH<sub> 50</sub>-Analysen ger ett mått på den kompletterar verksamheten i ett serumprov. Denna video visar de olika stegen i fastställandet av CH<sub> 50</sub> Av ett serumprov, beräkningar och tolkning av resultat.
Abstract
Komplementsystemet är en grupp av proteiner som när den aktiveras leder till målcellen lys och underlättar fagocytos genom opsonisation. Individuella komplement komponenter kan kvantifieras men detta inte ger någon information om verksamheten i vägen. CH<sub> 50</sub> Är en screening test för aktivering av den klassiska komplement vägen (figur 1) och den är känslig för minskning, frånvaro och / eller inaktivitet av någon del av vägen. CH<sub> 50</sub> Testar funktionsförmåga av serum komplement komponenter i den klassiska vägen till lyse får röda blodkroppar (SRBC) före belagda med kanin anti-får röda blodkroppar antikroppar (haemolysin). När antikroppsförsedda SRBC inkuberas med serum, den klassiska vägen av komplement aktiveras och resultat hemolys. Om ett komplement komponent är frånvarande, CH<sub> 50</sub> Nivå blir noll, om en eller flera delar av den klassiska vägen är minskat, CH<sub> 50</sub> Kommer att minskas. En bestämd volym optimalt sensibiliserade SRBC läggs till varje serum utspädning. Efter inkubation centrifugeras blandningen, och graden av hemolys kvantifieras genom att mäta absorbansen för hemoglobin ut i supernatanten vid 540nm. Mängden komplement verkan bestäms genom att undersöka kapaciteten i olika spädningar av testserum till lyse antikroppsförsedda SRBC. Denna video beskriver de experimentella stegen i att analysera graden av komplement aktiviteten av den klassiska komplement väg.
Protocol
Discussion
CH 50-analysen är föremål för många störningar. Några SRBC är mer ömtåliga än andra, vilket resulterar i spontana hemolys som inte har med komplement aktivitet. Affinitet kanin antikroppar varierar från parti till parti och från en tillverkare till en annan, vilket påverkar mängden antikroppar som binder till SRBC. Även arbetet med sensibiliserande SRBC med antikropp resulterar i celler med olika mängder antikroppar beläggning SRBC. Provtagning och lagring är en viktig potentiell källa til…
Acknowledgements
Författaren vill tacka fröken Lora Matthews för att utföra tekniken och Paul Shepherd för filmkonst. Projektet har finansierats av University of South Australia, laboratoriemedicin programmet.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sheep red blood cells | CSL | 2490201 | Use at 1% final | |
| Serum | Human serum | |||
| Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated | AdB Serotec | C12HSB | ||
| 96 well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1839 | ||
| Veronal buffered saline | Use at 1x final | |||
| Waterbath | ||||
| Plate reader | ||||
| 37°C room/incubator |
