Summary

Medir o Complemento de 50% hemolítica (CH 50) Atividade de soro

Published: March 29, 2010
doi:

Summary

A via clássica é ativada por anticorpos e culmina com a lise das células alvo. O CH<sub> 50</subEnsaio> fornece uma medida da atividade de complemento de uma amostra de soro. Este vídeo mostra os passos envolvidos na determinação do CH<sub> 50</sub> De uma amostra de soro, os cálculos e interpretação de resultados.

Abstract

O sistema complemento é um grupo de proteínas que, quando ativado levar a meta a lise das células e facilita a fagocitose através opsonisation. Componentes do complemento individual pode ser quantificado no entanto, este não fornece qualquer informação sobre a atividade da via. O CH<sub> 50</sub> É um ensaio de triagem para a ativação da via clássica do complemento (Fig. 1) e é sensível à redução, ausência e / ou inatividade de qualquer componente da via. O CH<sub> 50</sub> Testa a capacidade funcional de componentes do complemento sérico da via clássica para lisar hemácias de carneiro (SRBC) pré-revestida com anticorpos de coelho anti-células vermelhas do sangue de ovelhas (hemolisina). Quando revestidos com anticorpo SRBC são incubadas com soro de teste, a via clássica do complemento é ativado e os resultados hemólise. Se um componente do complemento está ausente, o CH<sub> 50</subNível> será zero, se um ou mais componentes da via clássica estão diminuídas, o CH<sub> 50</sub> Vai ser diminuída. Um volume fixo de SRBC ideal sensibilizados é adicionado a cada diluição do soro. Após a incubação, a mistura é centrifugada eo grau de hemólise é quantificada pela medida da absorbância da hemoglobina liberada no sobrenadante a 540 nm. A quantidade de atividade complementar é determinada examinando a capacidade de várias diluições do soro de ensaio para lisar SRBC revestidas de anticorpo. Este vídeo descreve os passos envolvidos na análise experimental do nível de atividade complementar da via clássica do complemento.

Protocol

Preparação de Saline Veronal 5x Buffered (VBS) Para preparar a solução salina Veronal Buffered (VBS), três soluções distintas precisa estar preparado. Prepare uma solução através da dissolução de NaCl e 21.25gm 0.94gm de Barbitone de sódio em 350ml de água destilada. A concentração final de NaCl e de sódio Barbitone são 1,02 e 13mm, respectivamente. Prepare a solução 2, dissolvendo 1.44gm de Barbitone em 125ml de água destilada quente. A concentração final de Barbito…

Discussion

O CH 50 ensaio está sujeito a muitas interferências. Alguns SRBC são mais frágeis do que outros, resultando em hemólise espontânea que não está relacionado para complementar a atividade. A afinidade do anticorpo de coelho varia de lote para lote e de um fabricante para outro, o que afeta a quantidade de anticorpo que se liga ao SRBC. Além disso, o processo de sensibilização SRBC com resultados de anticorpos em células com diferentes quantidades de anticorpos do revestimento SRBC. Coleta e armazena…

Acknowledgements

O autor gostaria de agradecer a senhorita Lora Matthews para executar a técnica eo Sr. Paul Pastor para a cinematografia. Este projeto foi financiado pela Universidade da Austrália do Sul, Laboratório curso de Medicina.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Sheep red blood cells   CSL 2490201 Use at 1% final
Serum       Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated   AdB Serotec C12HSB  
96 well flat bottom plate   Sarstedt 83.1839  
Veronal buffered saline       Use at 1x final
Waterbath        
Plate reader        
37°C room/incubator        

Referências

  1. Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. . Immunology. , (2003).
check_url/pt/1923?article_type=t

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Citar este artigo
Costabile, M. Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum. J. Vis. Exp. (37), e1923, doi:10.3791/1923 (2010).

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