Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür
Summary
Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.
Abstract
Commissural nöronların yaygın, embriyonik omurilik gelişim sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik bulunur ve aksonlar embriyonik gelişim sırasında kalıplaşmış yörüngeleri takip. Commissural aksonlar ilk Taban doğru ventral proje. Orta hatta geçtikten sonra, bu aksonlar, beyin tarafına doğru anteriora ve proje çevirin. Bu adımların her biri birkaç rehberlik ipuçlarının eylem tarafından düzenlenir. Commissural nöronlar yüksek oranda zenginleştirilmiş Kültürler ideal dönüm deneyleri, immünokimyanın ve biyokimya da dahil olmak üzere, akson yol bulma mekanizmaları, birçok deneyler için uygundur. Burada, E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, omurilik, izole edilir ve dorsal şeritler disseke vardır. Dorsal doku trypsinization ve mekanik bozulması hücre süspansiyonu sonra ayrışmış. Nöronlar, poli-L-lizin kaplı cam lamelleri veya doku kültürü yemekleri üzerine kaplanmıştır. 30 saat sonra<em> In vitro</em> En nöronların akson uzatıldı. Kültür saflık (Yam<em> Ve ark.</em> 2009), tipik olarak% 90 üzerinde, commissural nöron belirteçlerinin DCC, LH2 ve tag1 (Helms ve Johnson, 1998) ile immunolabeling tarafından değerlendirilir olabilir. Bu nöronal hazırlanması için yararlı bir araçtır.<em> In vitro</em> Hücresel ve moleküler mekanizmaları omurilik gelişimi sırasında commissural akson büyüme ve rehberlik çalışmalar.
Protocol
Discussion
Biz embriyonik sıçan omurilik commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür, laboratuvarda rutin olarak güvenilir bir akson rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışma nöronların hazırlamak için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve immünokimyanın deneyler, bir çöp diseksiyonu için yeterli nöron üretir. Daha fazla hücreler ihtiyaç olduğunda, birçok biyokimya deneyler, iki litre diseksiyonu gibi gerekli olabilir. Eğitimli bir kişi i…
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Peter Lougheed Tıbbi Araştırma Vakfı, Neuroengineering McGill Programının hibeleri ile desteklenen, Viyana de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Yenilik Kanada Vakfı (CFI .) Viyana Master Eğitim Ödülü Sébastien D. Langlois tarafından desteklenen de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri Frederick Banting ve Charles tarafından En İyi Kanada Lisansüstü Bursları Master Ödülü. Biz rakamları ile yardım için Jessica MT Pham müteşekkiriz.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
Referências
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
