التشريح المجهري والمجهر الإلكتروني الماسح الكامل للجبل تصور الضفيرة المشيمية للفأر
Summary
تلعب الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي نسيج غير مدروس في علم الأعصاب ، دورا رئيسيا في صحة ومرض الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول تقنية التشريح المجهري لعزل CP واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح للحصول على رؤية شاملة لهيكله الخلوي.
Abstract
الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي بنية شديدة الأوعية الدموية تبرز في بطينات الدماغ ، هي واحدة من أكثر الأنسجة غير المدروسة في علم الأعصاب. نظرا لأنه أصبح من الواضح بشكل متزايد أن هذا الهيكل الصغير يلعب دورا حاسما في صحة ومرض الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، فمن الأهمية بمكان تشريح الشلل الدماغي بشكل صحيح من البطينين في الدماغ بطريقة تسمح بالمعالجة النهائية ، بدءا من التحليل الوظيفي إلى التحليل الهيكلي. هنا ، يتم وصف عزل فأر البطين الدماغي الجانبي والرابع CP دون الحاجة إلى أدوات أو معدات متخصصة. تحافظ تقنية العزل هذه على صلاحية الخلايا ووظيفتها وهيكلها داخل CP. بسبب الأوعية الدموية العالية ، يمكن تصور CP عائما داخل تجاويف البطين في الدماغ باستخدام مجهر مجهر. ومع ذلك ، فإن التروية عبر القلب المطلوبة لتحليل المصب يمكن أن تعقد تحديد أنسجة CP. اعتمادا على خطوات المعالجة الإضافية (على سبيل المثال ، تحليل الحمض النووي الريبي والبروتين) ، يمكن حل ذلك عن طريق تصور CP عن طريق التروية عبر القلب مع بروموفينول الأزرق. بعد العزلة ، يمكن معالجة CP باستخدام العديد من التقنيات ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين أو الخلية المفردة ، لاكتساب مزيد من الفهم لوظيفة بنية الدماغ الخاصة هذه. هنا ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) على CP الكامل للحصول على رؤية شاملة للهيكل.
Introduction
تفصل الحواجز الضيقة الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط ، بما في ذلك الحاجز الدموي الدماغي (BBB) وحاجز السائل الدموي النخاعي (CSF). تحمي هذه الحواجز الجهاز العصبي المركزي من الإهانات الخارجية وتضمن بيئة دقيقة متوازنة وخاضعة للرقابة1،2،3. في حين تمت دراسة BBB على نطاق واسع بمرور الوقت ، فإن حاجز الدم CSF الموجود في الضفيرة المشيمية (CP) اكتسب اهتماما بحثيا متزايدا خلال العقد الماضي. يمكن العثور على هذا الحاجز الأخير في البطينين الأربعة للدماغ (الشكل 1 أ ، ب) ويتميز بطبقة واحدة من خلايا الضفيرة الظهارية المشيمية (CPE) المحيطة بالسدى المركزي ، والشعيرات الدموية المتسربة ، والخلايا الليفية ، وعدد الخلايا اللمفاوية والنخاعية (الشكل 1C)4,5,6 . ترتبط خلايا CPE ارتباطا وثيقا عن طريق تقاطعات ضيقة ، وبالتالي تمنع التسرب من الشعيرات الدموية الأساسية إلى السائل الدماغي الشوكي والدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنظيم النقل عبر خلايا CPE من خلال عدد من أنظمة النقل الداخلية والخارجية التي تدير تدفق المركبات المفيدة (مثل العناصر الغذائية والهرمونات) من الدم إلى السائل الدماغي الشوكي وتدفق الجزيئات الضارة (مثل النفايات الأيضية والناقلات العصبية الزائدة) في الاتجاه الآخر 1,6. لتكون قادرة على ممارسة وظيفة النقل النشطة ، تحتوي خلايا CPE على العديد من الميتوكوندريا في السيتوبلازم7. علاوة على ذلك ، فإن CP هو المصدر الرئيسي ل CSF ويعمل كحارس بوابة للدماغ من خلال وجود الخلايا الالتهابية المقيمة1. نظرا لموقعه الفريد بين الدم والدماغ ، فإن CP في وضع مثالي لإجراء المراقبة المناعية8.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على موقع وتكوين الضفيرة المشيمية (CP). (أ ، ب) يوجد نسيج CP داخل البطينين الجانبيين والثالث والرابع من (أ) دماغ الإنسان و (ب) الفأر. (ج) يتكون نسيج CP من طبقة واحدة من خلايا ظهارة CP مكعبة متصلة بإحكام (CPE) تحيط بالشعيرات الدموية الملتزة ، والنسيج الضام الرخو ، والخلايا اللمفاوية والنخاعية ، وتشكل حاجز السائل الدموي النخاعي (تم تكييفه وتعديله من المرجع23). تم إنشاء الشكل باستخدام Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على مدى العقد الماضي، كشفت أدلة متزايدة، بما في ذلك العديد من التقارير الصادرة عن مجموعتنا البحثية، أن الإنتاج الأنظف يلعب دورا مركزيا في الصحة والمرض9،10،11،12،13،14،15،16،17،18. على سبيل المثال ، من المعروف أن حاجز الدم CSF القديم يعرض تغيرات مورفولوجية في ، من بين أمور أخرى ، النوى ، الزغابات الدقيقة ، والغشاء القاعدي 1,19. بالإضافة إلى ذلك ، في سياق مرض الزهايمر ، تتعرض سلامة الحاجز العام للخطر ويبدو أن كل هذه التغييرات المرتبطة بالعمر أكثر وضوحا1،8،20. بالإضافة إلى التغيرات المورفولوجية ، يتم تغيير النسخ والبروتين وإفراز CP أثناء المرض12،21،22،23. وبالتالي ، فإن المعرفة المتقدمة بالإنتاج الأنظف ضرورية لفهم دوره في الأمراض العصبية بشكل أفضل وربما تطوير استراتيجيات علاجية جديدة.
طريقة فعالة للتشريح الدقيق لل CP من البطينين في الدماغ هي الخطوة الأولى التي لا تقدر بثمن للسماح بالتحقيق المناسب في بنية الدماغ الصغيرة هذه. نظرا لطبيعته الوعائية العالية (الشكل 2 ب) ، يمكن التعرف على CP العائم داخل تجاويف البطين في الدماغ باستخدام مجهر مجهر. ومع ذلك ، غالبا ما يكون التروية عبر القلب مطلوبا للتحليل النهائي ، مما يعقد التحديد الصحيح وعزل أنسجة CP (الشكل 2C). إذا سمحت خطوات المعالجة الإضافية (على سبيل المثال ، في حالة تحليل الحمض النووي الريبي والبروتين) ، يمكن تصور CP عن طريق التروية عبر القلب مع بروموفينول الأزرق (الشكل 2 أ). تصف العديد من المنشورات بالفعل عزل CP عن أدمغة الجرذ24 وجرو الفأر25. هنا ، يتم وصف تقنية عزل التشريح المجهري لعزل CP عن الفئران البالغة. الأهم من ذلك ، أن تقنية العزل هذه تحافظ على صلاحية الخلايا ووظيفتها وهيكلها داخل CP. يتم وصف عزل CP العائم في البطينين الرابع والجانبي هنا. باختصار ، يتم تخدير الفئران بشكل نهائي ، وإذا لزم الأمر ، يتم تعطيرها عبر القلب. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن التروية يمكن أن تلحق الضرر ببنية الخلايا داخل CP. وبالتالي ، إذا كان سيتم تحليل العينة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، أو المجهر الإلكتروني الماسح الإلكتروني للوجه التسلسلي (SBF-SEM) ، أو حزمة الأيونات المركزة SEM (FIB-SEM) ، فلا ينبغي إجراء التروية. بعد ذلك ، يتم عزل الدماغ كله ، ويستخدم الملقط لتشويه الدماغ سهميا. من هنا ، يمكن تحديد CPs العائمة في البطينين الجانبيين وتشريحها ، بينما يمكن عزل CP من البطين الرابع من الجانب المخيخي من الدماغ.
الشكل 2: تصور الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية (A-C) الرابعة و (D-F) بعد (A ، D) نضح البروموفينول الأزرق ، (B ، E) بدون تروية ، و (C ، F) التروية مع PBS / الهيبارين. يتم التقاط الصور بمجهر ستيريو (تكبير 8x-32x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بمجرد تشريح الشلل الدماغي بشكل صحيح من البطينين الدماغيين ، يمكن تطبيق ذخيرة كاملة من التقنيات لاكتساب مزيد من الفهم حول وظيفة هذا الهيكل. على سبيل المثال ، يمكن إجراء قياس التدفق الخلوي أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد وتحليل الخلايا الالتهابية المتسللة في ظل ظروف مرضية معينة26,27. بالإضافة إلى التركيب الخلوي ، يمكن تحليل التركيب الجزيئي لل CP لتقييم وجود السيتوكينات والكيموكينات عبر مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، أو اللطخة المناعية ، أو من خلال التحليل المتزامن للعديد من السيتوكينات باستخدام مصفوفة حبة السيتوكين28. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تحليلات النسخ والأوعية الدموية وأنسجة الخلايا المناعية والإفرازات على نباتات CP المجهرية29. هنا ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) على CP الكامل للحصول على رؤية شاملة لهيكل CP. يستخدم SEM حزمة من الإلكترونات المركزة لمسح السطح وإنشاء صورة لتضاريس السطح وتكوينه. نظرا لأن الطول الموجي للإلكترونات أصغر بكثير من الطول الموجي للضوء ، فإن دقة SEM تقع في نطاق النانومتر وتتفوق على دقة المجهر الضوئي. وبالتالي ، يمكن إجراء الدراسات المورفولوجية على المستوى دون الخلوي عبر SEM. باختصار ، يتم نقل CP التشريح على الفور إلى مثبت يحتوي على الجلوتارالدهيد للتثبيت بين عشية وضحاها ، يليه التناضح وتلطيخ خلات اليورانيل. ثم تتم معالجة العينات بصبغة الرصاص والأسبارتات ، المجففة ، وتضمينها في النهاية للتصوير.
وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول يسهل العزل الفعال لل CP من البطينين في دماغ الفأر ، والذي يمكن تحليله بشكل أكبر باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات المصب للتحقيق في هيكله ووظيفته.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف طريقة لعزل الضفيرة المشيمية (CP) من البطين الجانبي والبطين الرابع لدماغ الفأر. تسهل طريقة التركيب الكاملة للإنتاج الأنظف إجراء مزيد من التحليل باستخدام مجموعة من التقنيات للحصول على رؤية كاملة لمورفولوجيا الإنتاج الأنظف والتركيب الخلوي والنسخ والبروتين والإفرازات. مثل هذه ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البلجيكية لأبحاث الزهايمر (SAO ؛ رقم المشروع: 20200032) ، ومؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO Vlaanderen ؛ أرقام المشروع: 1268823N ، 11D0520N ، 1195021N) وصندوق Baillet Latour. نشكر VIB BioImaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات.
Materials
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
References
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
- Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
- Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
- Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
- Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
- Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
- Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer’s disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
- Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
- Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
- Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
- Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
- Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
- Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
- JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , (2022).
- Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).
