लेजर निर्देशित Neuronal का पता लगाने में ब्रेन Explants
Summary
हम इन विट्रो तैयारी का उपयोग कर मस्तिष्क नाभिक में अग्रगामी या प्रतिगामी अनुरेखक इंजेक्शन के माध्यम से न्यूरॉन्स और उनकी प्रक्रियाओं लेबल करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है। हम मैं n लेबलिंग शुद्धता को बढ़ाने के क्रम में लाभ की fluorescently लेबल माउस म्यूटेंट और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण लेने से दरियाफ्त इलेक्ट्रोपोरेशन विट्रो के एक मौजूदा पद्धति को संशोधित किया।
Abstract
हम प्रक्रिया के दौरान लक्षित लेजर रोशनी और मिलान फिल्टर चश्मे के साथ मस्तिष्क explants में electroporation के माध्यम से डाई तेज बढ़ाने के लिए बिजली और दबाव दालों की एक श्रृंखला का उपयोग करता है, जो इन विट्रो दरियाफ्त इंजेक्शन प्रोटोकॉल को जोड़ती है, जो एक तकनीक मौजूद है। स्वयं के द्वारा इन विट्रो electroporation की वर्णित तकनीक मस्तिष्क के कुछ क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत अच्छा दृश्य नियंत्रण अर्जित करता है। लेजर फ्लोरोसेंट आनुवंशिक मार्करों की उत्तेजना और उनके पढ़ने के लिए बाहर बैंड गुजर फिल्टर चश्मे के माध्यम से, आनुवंशिक रूप से लेबल की कोशिकाओं / नाभिक और फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग डाई के उत्सर्जन को चुन सकते हैं, जो एक शोधकर्ता काफी इंजेक्शन की सटीकता को बढ़ा सकते हैं के साथ संयोजन से रुचि के क्षेत्र को खोजने और अधिक कुशलता से इंजेक्शन क्षेत्र में डाई-प्रसार / तेज के लिए नियंत्रित करने से। इसके अलावा, लेजर रोशनी तकनीक नीति से एक दिया neurocircuit की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता हैGFP अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स की एक उप-जनसंख्या द्वारा व्यक्त ट्रांसमीटर के प्रकार से जुड़ा हुआ है जहां मामलों में एक निश्चित क्षेत्र के लिए पेश न्यूरॉन्स के प्रकार के बारे में जानकारी iding।
Introduction
एक निश्चित न्यूरोनल (माइक्रो) सर्किट को परिभाषित करने के लिए, एक ने कहा कि सर्किट, और उनके कनेक्शन पैटर्न के विभिन्न प्रतिभागियों को खोजने के द्वारा शुरू करनी चाहिए। कभी lesioning 1 के माध्यम से neuroanatomical ट्रेसिंग तकनीक की एक बड़ी विविधता ट्रेसिंग neurofiber के बारे में वालर के प्रकाशन स्थापित किया गया है के बाद से। 1971 5-6 में खोज के रूप में इन तकनीकों में से कुछ तय ऊतक पोस्टमार्टम 2-4 में लागू किया जा सकता है, दूसरों को, जी न्यूरॉन्स में डाई की सक्रिय परिवहन पर भरोसा करते हैं। बाद के आगे (एक दिया प्रक्षेपण के स्रोत, यानी करने के लिए इंजेक्शन क्षेत्र से। क्षेत्र कहा करने के लिए पेश कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स के somata) सक्रिय प्रतिगामी का लाभ लेने के तरीकों के बीच भेदभाव को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है और सक्रिय अग्रगामी (इंजेक्ट से एक दिया प्रक्षेपण का लक्ष्य है, यानी। axonal अनुमानों और लेबल न्यूरॉन्स) परिवहन की axonal टर्मिनलों के लिए क्षेत्र। इसके अलावा, कुछ मामलों में टीआरएप्रमाणपत्र सामग्री तो अन्य मामलों में explanted दिमाग इंजेक्ट कर रहे हैं, जबकि (विवो दरियाफ्त इंजेक्शन में) कई दिनों या हफ्तों के द्वारा इंजेक्शन जीवित और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में इंजेक्शन के बाद कई घंटे के लिए सेते हैं जो जीवित पशुओं में इंजेक्ट किया जाता है (इन विट्रो दरियाफ्त इंजेक्शन) ।
इस प्रोटोकॉल में हम इन विट्रो electroporation तकनीक 7-8 में मौजूदा एक ट्रेसिंग पदार्थ के रूप में choleratoxin सबयूनिट-बी और tetramethylrhodamine dextran का उपयोग अग्रगामी और प्रतिगामी ट्रेसिंग प्रयोगों में neuronal somata और प्रक्रियाओं को लेबल करने के लिए संशोधित किया। इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य दरियाफ्त इंजेक्शन के दौरान निशाना बना शुद्धता को बढ़ाने के क्रम में उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस लाइनों और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण का लाभ ले रही है, जबकि अलग मस्तिष्क नाभिक के बीच न्यूरोनल कनेक्टिविटी पैटर्न का पता लगाने के लिए एक कुशल उपकरण के साथ neuroscientists प्रदान करना है। अग्रगामी और प्रतिगामी ट्रेसिंग की विधि का उपयोग हालांकिcholeratoxin और dextran अमाइन और उनके संबंधित fluorescently लेबल conjugates 9-13 नया नहीं है (उदाहरण के लिए। हास एट अल electroporation की विधि के रूप में है। 14), मस्तिष्क के ऊतकों के ब्लॉक से जुड़े इन विट्रो तैयारी में electroporation के साथ दरियाफ्त इंजेक्शन के संयोजन एक और अधिक हाल ही में विकास 7 है। जीवित पशुओं में दरियाफ्त रंगों का एक ही प्रकार का उपयोग न्यूरोनल ट्रेसिंग तकनीक पर इसका मुख्य लाभ क्योंकि electroporated डाई न्यूरॉन्स द्वारा लिया जा रहा है, जिसके साथ उच्च दक्षता की वृद्धि हुई है, लेबलिंग तीव्रता है। प्रयोगकर्ता इंजेक्शन का लक्ष्य क्षेत्र से अधिक दृश्य नियंत्रण नहीं है क्योंकि एक अतिरिक्त लाभ, ट्रेसर इंजेक्शन के दौरान (डाई परिवहन के लिए आवश्यक) छोटा ऊष्मायन अवधि और इसकी वृद्धि लक्ष्य सटीकता है। बाद में भी कोई महंगा स्टीरियोटैक्टिक उपकरण ब्याज के नाभिक या मस्तिष्क क्षेत्र को खोजने के लिए आवश्यक है कि इसका मतलब है।
Addi करने के लिएtionally हम 405 एनएम तरंगदैर्ध्य और मिलान बैंड पास छानने के चश्मे की एक हाथ से आयोजित लेजर सूचक (450 से मिलकर न्यूरॉन्स 15 और बुनियादी ऑप्टिकल उपकरण के अपने glycinergic उप-जनसंख्या में GFP व्यक्त करता है जो एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का फायदा उठाया, सटीकता को लक्षित वृद्धि – 700 एनएम)। इस प्रकार, हम अपने फ्लोरोसेंट संकेत के माध्यम से इंजेक्शन क्षेत्र की पहचान करके सटीकता को निशाना बनाने में और स्वदेशी GFP संकेत और दरियाफ्त के बीच बातचीत का अवलोकन के माध्यम से इंजेक्शन क्षेत्र के भीतर डाई प्रसार के लिए नियंत्रित करने के लिए एक महीन तरीका प्रदान करके एक महत्वपूर्ण और वृद्धि हासिल की प्रतिदीप्ति। हमारी तकनीक भी दरियाफ्त से भर गया है कि (अन्य माउस लाइनों में या उत्तेजक) ने अपने GFP पॉजिटिव निरोधात्मक न्यूरॉन्स की पहचान करके कनेक्टिविटी के साथ एक सर्किट की कार्यक्षमता को उजागर करने की अनुमति देता है।
सारांश में, हम आगे कशेरुकी मस्तिष्क के connectome अध्ययन और टी का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली neuroscientific उपकरण बढ़ायावह एक दिया neurocircuit के विभिन्न neuroanatomical सुविधाओं। सस्ती और व्यापक रूप से उपलब्ध ऑप्टिकल उपकरण के साथ-साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके हम काफी हमारे इंजेक्शन का निशाना बना शुद्धता बढ़ाने के लिए सक्षम थे। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों श्रवण brainstem में एक निरोधात्मक microcircuit की कार्यक्षमता को उजागर करने में मदद मिली है, जो पता लगाया कनेक्शन, के प्रकार की पहचान करने की अनुमति दी।
Protocol
Representative Results
Discussion
, इन विवो ट्रेसिंग के अध्ययन के लिए विरोध के रूप में इन विट्रो दरियाफ्त electroporation की एक सामान्य शक्ति, महंगा स्टीरियोटैक्टिक (और अक्सर electrophysiological) उपकरण शामिल नहीं है, यह शोधकर्ताओं इसलिए ब्याज और मस्ति?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच द्वारा समर्थित / NIDCD R01 डीसी 011582. इमेजिंग प्रयोगों कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैम्पस उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी कोर विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया एनआईएच / NCRR कोलोराडो CTSI अनुदान संख्या UL1 RR025780 और रॉकी पर्वत Neurlogical विकार कोर केंद्र अनुदान एनआईएच P30NS048154 द्वारा समर्थित। सॉल्क संस्थान से डॉ साशा डू लैक GlyT2 GFP के चूहों के साथ हमें प्रदान की है।
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
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