概要

ポリオールベース技術を用いた化粧品用途向けのフェノール化合物および酸化防止剤のマイクロ波支援抽出

Published: August 23, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、フェノール化合物と天然酸化防止剤を抽出するためのポリオールベースのマイクロ波支援抽出法の利用を詳述しており、すぐに使用できる抽出物の開発に対する実用的で環境的に持続可能なアプローチを表しています。

Abstract

ポリオールは、植物原料から生理活性化合物を抽出するためのグリーン溶媒として、その安全性と植物生理活性化学物質との不活性な挙動から注目されています。この研究では、グリセリン、プロピレングリコール(PG)、ブチレングリコール(BG)、メチルプロパンジオール(MPD)、イソペンチルジオール(IPD)、ペンチレングリコール、1,2-ヘキサンジオール、ヘキシレングリコール(HG))などのポリオールベースの溶媒を用いたマイクロ波支援抽出法を使用して、コーヒーシルバースキンからフェノール化合物と天然抗酸化物質を持続的に抽出する方法を調査しています。総フェノール含有量(TPC)、総フラボノイド含有量(TFC)、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルラジカル捕捉アッセイ(DPPH)、2,2′-アジノ-ビス(-3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ラジカル捕捉アッセイ(ABTS)、鉄還元酸化防止パワーアッセイ(FRAP)などの抗酸化活性活性などのパラメーターを含む、MAEの生理活性化合物への影響に焦点を当てて、従来型および非従来型の溶媒抽出について比較分析を行いました。最も高い値は、水性 1,2-ヘキサンジオール抽出による TPC(52.0 ± 3.0 mg GAE/g サンプル)、水性 1,2-ヘキサンジオール抽出による TFC(20.0 ± 1.7 mg QE/g サンプル)、DPPH 水性 HG 抽出(13.6 ± 0.3 mg TE/g サンプル)、ABTS 水性ペンチレングリコール抽出(8.2 ± 0.1 mg TE/g サンプル)、FRAP 水性 (21.1 ± 1.3 mg Fe (II) E/g サンプル) で観察されました。この研究は、天然植物成分による環境に優しい抽出技術を推進し、危険な化学物質の使用を最小限に抑えながら時間とエネルギー消費を削減することで持続可能性を促進し、化粧品への応用の可能性を秘めています。

Introduction

今日、美容業界では環境意識への世界的な傾向があり、メーカーは持続可能な代替品を使用して植物成分を抽出するためのグリーンテクノロジーに焦点を当てるようになりました1。通常、エタノール、メタノール、ヘキサンなどの従来の溶媒は、植物フェノール成分と天然抗酸化物質を抽出するために使用されます2。それにもかかわらず、植物抽出物中の溶媒残留物の存在は、人間の健康に潜在的なリスクをもたらし、特に化粧品への意図された用途に関して、皮膚や眼の炎症を誘発します3。その結果、抽出物からこのような溶媒残留物を除去することは困難であり、このプロセスには時間、エネルギー、および人的資源に多大な投資が必要です4。近年、過熱水、イオン液体、深部共晶溶媒、およびバイオ由来溶媒が、グリーン溶媒抽出の有望なアプローチとして浮上しています5。しかし、水系プロセスでの製品分離により、その使用は依然として制限されています。これらの課題に対処するために、すぐに使用できる抽出物の開発が実行可能な解決策として浮上しています6

ポリオールは、その優れた極性と環境からの水分を保持する能力があるため、保湿剤として化粧品の配合物によく使用されます7。さらに、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルプロパンジオール、イソペンチルジオール、ペンチレングリコール、1,2-ヘキサンジオール、ヘキシレングリコールなどのポリオールを植物抽出に利用できます。それらは、植物抽出8に使用するための無毒で、生分解性で、環境にやさしく、非反応性で、安全な溶媒と考えられています。さらに、ポリオールは沸点と極性が高いため、マイクロ波支援抽出(MAE)中に発生する熱に耐えることができます9。これらのポリオールは、米国食品医薬品局(FDA)によって一般に安全(GRAS)化学物質として認められています。エタノールやメタノールなどの従来の溶媒とは異なり、ポリオールは、その潜在的に有害な影響のために抽出物からの厳密な除去を必要とする場合があり、溶媒除去プロセスに関連するエネルギー、時間、およびコストを最小限に抑えるという利点を提供する10。これにより、抽出プロセスが合理化されるだけでなく、抽出方法の全体的な効率と持続可能性も向上します。これまでの研究では、 Camellia sinensis の花10 およびコーヒーパルプ11からの生理活性化合物の抽出において、プロピレングリコールやブチレングリコールなどのポリオールを溶媒として使用しており、植物抽出プロセスにおける持続可能な代替溶媒としての役割に大きな可能性が明らかになっている。したがって、ポリオール-水溶媒システムの継続的な開発と最適化は、グリーンケミストリーと持続可能な産業慣行の大幅な進歩の可能性を秘めています。

一般に、植物に見られる生理活性化合物は二次代謝産物として合成されます。これらの化合物は、テルペンとテルペノイド、アルカロイド、およびフェノール化合物の3つの主要なグループに分類できます12。植物から特定の生理活性化合物を単離するために、さまざまな抽出方法がさまざまな条件下で利用されます。植物材料からの生理活性化合物は、従来の技術または非従来の技術のいずれかを使用して抽出できます。従来の方法には、浸軟、還流抽出、および水蒸留が含まれますが、非従来型の方法は、超音波支援抽出、酵素支援抽出、マイクロ波支援抽出(MAE)、パルス電界支援抽出、超臨界流体抽出、および加圧液体抽出13で構成されます。これらの従来とは異なる方法は、より安全な溶剤と助剤を利用し、エネルギー効率を改善し、生物活性成分の劣化を防ぎ、環境汚染を減らすことにより、安全性を高めるように設計されています14

さらに、MAEは、植物から生理活性化合物を抽出するための洗練されたグリーンテクノロジーの1つです。従来の抽出手順では、かなりの時間、エネルギー、および高温が必要であり、時間の経過とともに熱に敏感な生理活性化合物を劣化させる可能性があります13。従来の熱抽出とは対照的に、MAEは、サンプル内に局所的な加熱を発生させ、細胞構造を破壊し、物質移動を促進することにより、生理活性化合物の抽出を促進し、それによって化合物抽出の効率を高めます。熱は、植物成分13内の水分子に作用するマイクロ波によって植物細胞内部から伝達される。さらに、MAEは、活性化合物の抽出と分離を改善し、製品の収率を高め、抽出効率を高め、必要な化学物質を減らし、生理活性化合物の破壊を防ぎながら時間とエネルギーを節約するために進歩しました15

この研究では、さまざまな種類のポリオールを溶媒として使用したマイクロ波支援抽出(MAE)による植物フェノール化合物と天然抗酸化物質の抽出に焦点を当てています。ポリオールベースのMAE抽出物の総フェノール含有量(TPC)、総フラボノイド含有量(TFC)、および抗酸化活性(DPPH、ABTS、FRAP)が決定されます。さらに、ポリオールベースのMAEは、水やエタノールなどの従来の溶媒を使用してMAEと比較されます。この研究は、化粧品業界での潜在的な用途のために、有害化学物質への依存を減らし、処理時間を短縮し、原材料生産におけるエネルギー消費を最小限に抑えることにより、持続可能性を促進し、天然成分の環境的に持続可能な抽出技術の開発に貢献することが期待されています。

Protocol

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。 1. 実験の準備 植物サンプル調製淹れたてのコーヒーシルバースキン(Coffea arabica)を集め、トレイドライヤーで60°Cで72時間11分乾燥させます。 乾燥したコーヒーシルバースキン(CS)をグラインダーを使用して微粉末に挽き、さらなる分析のために室温で保存します11。注:この研究では、新鮮なCS(C.arabica)がタイのチェンライにあるメースアイ地区のバーンドイチャンから収集されました。CSは、籾摺り加工中に得られる副産物で、サクランボが外側の果実層16を除去するために加工された後、乾燥コーヒー豆から羊皮紙層を除去する。 化学薬品実験の溶媒を除き、分析グレードの品質の化学試薬を使用してください。注:実験では化粧品グレードの溶媒を使用しました。 MAEによるCSの抽出には、溶媒(水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、イソペンチルジオール、1-2ヘキサンジオール、ペンチレングリコール、メチルプロパンジオール)を使用してください。 2.抽出プロセス サンプルと溶媒の調製MAE手順用のサンプルと溶媒を、以前に報告されたプロトコル9 に従って調製し、いくつかの変更を加えます。 各溶媒を60 mLを蒸留水で希釈し、容量を100 mLに調整して三重抽出することにより、各溶媒を60%濃度で調製します。注意: 水の抽出には100%蒸留水を使用してください。 0.67 g の CS を秤量し、各抽出溶媒 20 mL と 1:30 の比率で MAE の反応容器 (図 1A) で混合します。注:各容器の最大固液量は、2 gのサンプルと20 mLの溶媒です。 各容器にマグネチックスターラーバーを追加して、サンプル内の熱と溶媒が均一に分布するようにすることで、抽出プロセスの効率を高め、抽出収率を向上させます。注:抽出プロセスに非極性溶媒を適用する場合は、マグネチックスターラーバーの代わりにテフロンスターラーバーを使用して、マイクロ波システムを介して効果的な加熱を提供できます。 各容器を特別な工具(図2)でしっかりと閉じ、すべての容器をMAEチャンバーに入れます(図1B)。 マイクロ波支援抽出装置と手順のセットアップいくつかの変更を加えた参照プロトコルに従って抽出手順を実行する9。 モニター画面を開き、トップバーの ツールボックス アイコンをクリックし、アクセサリセクションで SK eTローター を選択してメソッドを設定します(図3A、B)。 スター ラー セクションをクリックして 20% と入力し、スターラーバーの攪拌速度を選択します(図4A)。注:攪拌速度は0%から100%まで選択できます。 ドアロックセクターをクリックし、80°Cを超える温度でアクティブになるように設定します(図4B)。注:この設定により、内部温度が80°Cを超えたときにチャンバードアが自動的に閉じられます。 トップバー(図5A)のテーブルアイコンをクリックし、温度勾配(T1)を抽出時間を10分、マイクロ波電力を1800W、温度を120°Cに設定します。 緑色のライトが表示されるまで スターラー ボタンをクリックして、スターラーをアクティブにします。 ブロワーファンの速度をレベル3(最大)に設定します(図5B)。 抽出時間を保持するには、抽出時間を15分、マイクロ波電力を1800W、温度を120°Cに設定して、目的の抽出温度(T2)を選択します。 セクション2.2.6および2.2.7に記載されているように、スターラーとファンの速度を設定します(図5A、B)。注:最大温度とマイクロ波電力は260°Cと1800Wです。 画面の左下隅にある 冷却 ボタンをクリックし、 10分間 の時間を選択して、冷却時間を設定します(図6)。 画面の右上隅にある 保存 アイコンをクリックして、メソッドを保存します(図7A)。 メソッド条件を保存した後、抽出条件グラフが右下隅の再生ボタンで画面に表示されることを確認します(図7B)。 使用する容器の数を選択して、抽出プロセスを開始します(図7C)。注:1回の抽出で最大15個の容器を使用でき、必要な数の容器を使用する場合は、チャンバー内の容器をバランスよく配置してください。 抽出後、抽出物を4°C、9072 x gで、冷蔵遠心分離機を使用して15分間遠心分離します。 上清を10 mLのガラス製ピペット(図8)で収集し、-20°Cで冷凍庫に保存してさらに研究します。注:植物残渣の粒子サイズと密度に応じて、抽出物はより長い遠心分離時間(20〜30分)を必要とします。 3. フェノール化合物の定量 総フェノール含有量の測定CS抽出物の総フェノール含有量を、いくつかの修飾を含むプロトコルを参照することにより決定する17。 蒸留水で希釈して、サンプルを10倍希釈して調製します。 希釈したサンプル10 μLを希釈したFolin-Ciocalteu試薬20 μLと混合し、3分間反応させます。 次に、100μLの7.5%Na2CO3 溶液を96ウェルプレートの各ウェルの混合物に加えます。 没食子酸の標準濃度範囲( 表1 および 表2を参照)に対して、蒸留水で希釈することにより、異なる濃度を調製します。 これらを20 μLのFolin-Ciocalteu試薬と混合し、3分間反応させます。 次に、100μLの7.5%Na2CO3 溶液を96ウェルプレートの各ウェルの混合物に加えます。 反応を室温の暗所で30分間インキュベートします。 マイクロプレートリーダーを使用して、765 nmでの反応溶液の吸光度を測定します(図9A)。 765 nm での標準試料と吸光度の濃度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10A)。 結果をサンプルの g あたりの没食子酸当量(GAE)の mg として表し、次の式18 を使用して計算します。注:サンプル1gあたりの没食子酸当量(GAE)のmg=[((A765-c )/ m))(没食子酸換算μg×反応ウェルの総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]ここで、c = y 切片、m = 傾き 総フラボノイド含有量の決定いくつかの変更を加えたプロトコルに従って、CS抽出物の総フラボノイド含有量を決定する17。 蒸留水で希釈することにより、サンプルを5倍希釈して調製します。 希釈したサンプル50 μLを5% NaNO2 15 μLに加え、暗所で5分間インキュベートします。 10% AlCl3 溶液15 μLを反応液と混合し、室温で6分間保存します。 次に、100 μLの1 M NaOH溶液を反応液に加え、さらに10分間インキュベートします。 510 nmでの混合物の吸光度を測定します(図9B)。 ケルセチン標準液(表3および表4を参照)を15 μLの5% NaNO2に添加し、暗所で5分間インキュベートすることにより、異なる濃度のケルセチン標準液を調製します(表3および表4を参照)。 15 μLの10% AlCl3 溶液を反応液と混合し、室温で6分間保存します。 100 μLの1 M NaOH溶液を反応液に加え、さらに10分間インキュベートします。 510 nm での標準試料の吸光度を測定します(図 9B)。 標準試料の濃度と 510 nm での吸光度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10B)。 結果をサンプルの g あたりのケルセチン当量(QE)の mg として表し、式19 で次のように計算します。注:サンプル1gあたりのケルセチン当量(QE)のmg=[((A、510-c )/m))、μgケルセチン当量×反応ウェルの総容量(mL)x希釈×乾燥サンプルの重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]ここで、c = y 切片、m = 傾き 4.抗酸化活性の測定 1,1-ジフェニル-2-ピクリル-ヒドラジル(DPPH)ラジカル捕捉アッセイいくつかの変更を加えたプロトコルに従って、CS抽出物のDPPHラジカル捕捉活性を決定します17。 サンプルを蒸留水で希釈することにより、サンプルを10倍に希釈して調製します。 希釈したサンプル20 μLを0.1 mM DPPH溶液135 μLと混合します。 135 μL の 0.1 mM DPPH 溶液と混合して、Trolox 標準濃度範囲 ( 表 5 および 6 を参照) の異なる濃度を調製します。 混合物を室温で暗所で30分間インキュベートします。 517 nmで得られた結果の吸光度を測定します(図9C)。 標準試料の濃度と阻害率(%)を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10C)。 DPPHアッセイの阻害率を次のように計算します。抑制率 = [(コントロールの吸光度 − サンプルの吸光度)/コントロールの吸光度] × 100 結果を、次の式20で計算した、サンプルのgあたりのTrolox等価抗酸化能力のmgとして表します。注:サンプル1gあたりのトロロックス当量(TE)のmg=[((%阻害-c)/ m)(μgトロロックス当量)×反応ウェル内の総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]ここで、c = y 切片、m = 傾き 2,2′-アジノ-ビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)ラジカル消去法CS抽出物のABTSラジカル消去活性を、いくつかの変更を加えたリファレンス17のプロトコルを使用して決定します。 7 mM ABTSと2.45 mM過硫酸カリウム(1:2)を混合してABTS·+ストック溶液を調製し、室温で16時間暗所でインキュベートします。 5 mLのABTS·+ストック溶液と100 mLの脱イオン水を混合して、作業溶液を調製します。 160 μL の ABTS·+ ワーキング溶液を、10 倍希釈サンプルまたは Trolox 標準試料 10 μL と異なる濃度で混合します ( 表 7 および 表 8 を参照)。 反応を暗所で室温で30分間インキュベートします。 734 nmでの混合物の吸光度を測定します(図9D)。 標準試料の濃度と阻害率(%)を使用して、標準検量線をプロットします(図 10D)。 次の式を使用して、ABTSアッセイの阻害率を計算します。% 阻害率 = [(コントロールの吸光度 – サンプルの吸光度) / コントロールの吸光度] × 100。結果を、サンプルの g あたりの Trolox 等価抗酸化能力の mg として表し、次の式21 を使用して計算します。注:サンプル1gあたりのトロロックス当量(TE)のmg=[((%阻害-c)/ m))μgトロロックス当量×反応ウェルの総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]ここで、c = y 切片、m = 傾き 鉄還元酸化防止剤パワーアッセイ(FRAP)CS抽出物の鉄還元抗酸化活性を、いくつかの変更を加えたプロトコルに従って決定します17。 40 mM HCl 中の 10 mM TPTZ 溶液と 20 mM FeCl3.6H 2O 溶液を 10:1:1 の比率で混合した pH 3.6 の 30 mM アセテート緩衝液を使用して FRAP 試薬を調製します。 必要になるまで、FRAP試薬を琥珀色のボトルに入れます。注:FRAP試薬が茶色であることを確認してください。金属イオンやその他の反応性化合物で汚染されると、試薬は紫色に変わり、廃棄する必要があります。調製したばかりの試薬のみを使用してください。 サンプルを蒸留水で希釈することにより、サンプルを5倍に希釈して調製します。 希釈したサンプル10 μLまたはFeSO4.7H 2Oの20 μLを異なる標準濃度(表9 および 表10)でFRAP溶液180 μLに加えます。 反応を室温で4分間インキュベートします。 593 nmでの混合物の吸光度を評価します(図9E)。 593 nm での標準試料と吸光度の濃度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10E)。 結果をサンプルのgあたりのFeSO4のmgとして表し、次の式21を使用して計算します。注:mg FeSO4 相当量(Fe(II)E)/gサンプル= [((A593 – c)/ m)) μg FeSO4 相当量 × 反応ウェルの総容量(mL)×希釈×乾燥サンプルの重量(1 g)×抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)×乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]ここで、c = y 切片、m = 傾き 各サンプルのすべてのアッセイ(TPC、TFC、DPPH、ABTS、FRAP)を3回に分けて実施します。この研究では、ほとんどのアッセイで水がブランクとして使用されましたが、DPPHではエタノールがバックグラウンド吸光度に対処するためのブランクとして機能しました。 5. 統計分析 SPSSソフトウェアを使用して、実験データの統計分析を実行します。 Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性検定を実施します。 ポリオールベースのMAE CS抽出物と従来の溶媒ベースのMAE CS抽出物の生理活性物質と抗酸化活性を、一元配置分散分析とDuncanのマルチレンジテストを使用して比較します。 すべてのデータを平均± SD(n = 3)として表し、 p < 0.05 の有意水準を定義します。

Representative Results

総フェノール含有量、総フラボノイド含有量、DPPH、FRAP、およびABTS抗酸化アッセイに対するポリオール溶媒および従来型溶媒の影響溶媒の極性は、植物からの生理活性物質の抽出効率を改善するために、標的活性分子の極性と一致するべきである22。各種溶媒(水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルプロパンジオ?…

Discussion

MAEの成功には、植物成分の植物化学含有量、抽出時間、温度、マイクロ波電力、固液比、溶媒濃度など、さまざまな要因が重要な役割を果たします13。植物は通常、植物化学物質のさまざまなプロファイルを示します。したがって、抗酸化物質とフェノール化合物が豊富な天然植物の選択が不可欠です23。さらに、異なる生理活性成分は、使用する溶媒に応…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、メーファールアン大学から資金提供を受けました。著者らは、コーヒーシルバースキンサンプルの取得に関して研究者と地元の農家とのつながりを促進してくれたメーファールアン大学の紅茶コーヒー研究所に感謝したいと思います。

Materials

1,2-Hexanediol Chanjao Longevity Co., Ltd.
2,2 -Azino-bis 3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt (ABTS) Sigma A1888
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Sigma D9132
2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) Sigma 93285
2-Digital balance Ohaus Pioneer
4-Digital balance Denver SI-234
6-hydroxy-2,5,7,8 tetramethylchroman -2-carboxylic acid (Trolox) Sigma 238813
96-well plate SPL Life Science
Absolute ethanol RCI Labscan 64175
Acetic acid RCI Labscan 64197
Aluminum chloride Loba Chemie 898
Automatic pipette Labnet Biopett
Butylene glycol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Ethos X advanced microwave extraction Milestone Srl, Sorisole, Italy
Ferrous sulfate Ajex Finechem 3850
Folin-Ciocalteu's reagent Loba Chemie 3870
Freezer SF Sanyo C697(GYN)
Gallic acid Sigma 398225
Grinder Ou Hardware Products Co.,Ltd
Hexylene glycol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Hydrochloric acid (37%) RCI Labscan AR1107
Iron (III) chloride Loba Chemie 3820
Isopentyldiol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Methanol RCI Labscan 67561
Methylpropanediol  Chanjao Longevity Co., Ltd.
Pentylene glycol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Potassium persulfate Loba Chemie 5420
Propylene glycol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Quercetin Sigma Q4951
Refrigerated centrifuge Hettich
Sodium acetate Loba Chemie 5758
Sodium carbonate Loba Chemie 5810
Sodium hydroxide RCI Labscan AR1325
Sodium nitrite Loba Chemie 5954
SPECTROstar Nano microplate reader BMG- LABTECH
SPSS software IBM SPSS Statistics 20
Tray dryer France Etuves XUE343

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記事を引用
Myat Win, S., Saelee, M., Myo, H., Khat-Udomkiri, N. Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Compounds and Antioxidants for Cosmetic Applications Using Polyol-Based Technology. J. Vis. Exp. (210), e67033, doi:10.3791/67033 (2024).

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