הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב
概要
אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.
Abstract
תיקון שברים כפולי גדיל של DNA (DSBs) חיוני לשמירה על יציבות הגנום ועל כדאיות התא. תיקון DSB (DSBR) בתאים מתווך באמצעות מספר מנגנונים: רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) וחישול גדיל יחיד (SSA). בדיקות תאיות חיוניות למדידת המיומנות והאפנון של מסלולים אלה בתגובה לגירויים שונים.
כאן, אנו מציגים חבילה של מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים שכל אחד מהם מודד את המבנה מחדש של גן כתב ננולוציפראז על ידי אחד מארבעת מסלולי DSBR העיקריים בתאים. עם טרנספקציה חולפת לתאים בעלי עניין, ניתן למדוד תיקון של מצעי כתב ספציפיים למסלול תוך פחות מ-24 שעות על ידי זיהוי של לומינסנציה של ננולוציפראז (NanoLuc).
בדיקות חזקות אלה הן כמותיות, רגישות, ניתנות לטיטרציה וניתנות להתאמה לפורמט סינון בתפוקה גבוהה. תכונות אלה מספקות יישומים נרחבים במחקר תיקון DNA וגילוי תרופות, ומשלימות את ערכת הכלים הקיימת כיום של בדיקות DSBR תאי.
Introduction
שברי גדיל כפול של דנ”א (DSB) מייצגים סוג רעיל במיוחד של נזק לדנ”א1 שבגללו תאים פיתחו מסלולי תיקון DSB מרובים (DSBR) כדי לתקן נגעים אלה. ארבעת מנגנוני DSBR העיקריים הם רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ), וחישול גדיל יחיד (SSA)2,3. מסלולי DSBR תורמים לשמירה על התפתחות רקמות בריאות ופיזיולוגיה ומגנים מפני מחלות כגון סרטן. יתר על כן, מנגנוני תיקון אלה טומנים בחובם פוטנציאל טיפולי לפיתוח מודולטורים של מולקולות קטנות באונקולוגיה מדויקת. לדוגמה, התמקדות בדנ”א פולימראז θ (Polθ), אנזים מרכזי במסלול תיקון MMEJ, משכה עניין בשל הקטלניות הסינתטית שלו עם מחסור ב-HR בסרטן4.
להבנת DSBR יש אפוא השלכות קליניות רחבות ויש צורך בבדיקות תאיות פונקציונליות המסוגלות למדוד את הפעילות של כל מסלולי DSBR העיקריים5. הבדיקות חייבות להיות מתאימות הן לחקירה גנטית והן לחקירה פרמקולוגית וניתנות לפריסה על פני מודלים תאיים בעלי עניין. כדי לתמוך במאמצי גילוי תרופות של מולקולות קטנות, הבדיקות חייבות להיות רגישות מאוד, ניתנות לטיטרציה, בעלות תפנית מהירה וניתנות להרחבה לפורמטים בעלי תפוקה גבוהה המתאימים לסינון מורכבים.
באופן כללי, DSBR נמדד בעבר באמצעות מערכות בדיקת כתב מבוססות פלואורסצנטיות המשולבות ביציבות בגנום התא6. עם זאת, בעוד ששחזור פיזיולוגי של DSBR כרומוזומלי הוא יתרון מובהק, בדיקות כאלה מוגבלות למודל מארח שבו הכתב משולב, משתמשות בהכנת דגימות עתירות עבודה וניתוח לפי ציטומטריית זרימה, ויש להן תפוקה, זמן אספקה, חוסן ורגישות מוגבלים, כל התכונות החיוניות הדרושות למאמצי גילוי תרופות.
כאן אנו מתארים חבילה של מבחני כתבי DSBR המאפשרים הערכה של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים. חבילת מצעי בדיקת הכתבים מתוארת באיור 1 ומתוארת עוד יותרבפרסום 7 שפורסם לאחרונה. הם חוץ-כרומוזומליים, המאפשרים את הכנסתם לתאים על ידי טרנספקציה חולפת פשוטה, ושילוב של גן כתב ננולוציפראז8, אשר חייב להיות משוחזר על ידי מעורבות עם מנגנוני DSBR ספציפיים, מוליד רגישות, חוסן ומדרגיות. גרסאות המצע הבאות של כתב DSBR כלולות בפרוטוקול (איור 1):
MMEJ בלתי תלוי כריתה: מצע ליניארי זה מורכב מאזור ליבה של דנ”א דו-גדילי (dsDNA) עם דנ”א חד-גדילי (ssDNA) מעל, המחקה את קצוות הדנ”א המנותחים9. ארבע מיקרוהומולוגיות נוקלאוטידים בקצה של אזורי ssDNA מקודדות את קודון ההתחלה של הגן המדווח. תיקון מצע זה באמצעות MMEJ משחזר את מסגרת הקריאה הפתוחה של גן המדווח (ORF).
MMEJ תלוי כריתה: הגן אקסון N-terminal reporter מופרע על ידי קטע המכיל קודון עצירה, אשר משני צדדיו 8 מיקרוהומולוגיות של זוג בסיסים (bp). כריתת קצה נוקלאוליטית נדרשת לפני תיקון בתיווך MMEJ כדי לשחזר את גן המדווח השלם.
NHEJ בוטה: גן הכתב מחולק למקטעים N ו- C טרמינליים, שהאחרון ממוקם במעלה הזרם של המקדם. ה- DSB מיוצר באמצעות EcoRV והוא דורש קשירה ישירה (ללא עיבוד סופי) על ידי NHEJ כדי ששני חלקי הגן המדווח יחוברו מחדש וה- ORF המדווח ישוחזר.
NHEJ לא בוטה: ה- DSB ממוקם בתוך אינטרון ויהיו לו קצוות מלוכדים או לא מגובשים בהתאם לבחירת אנזים ההגבלה. תיקון מצע זה על ידי NHEJ דורש קשירה שקודמת לעיבוד סופי.
תבנית ארוכה HR: האקסון N-terminal של הגן המדווח נקטע על ידי מקטע DNA המכיל אתרי הגבלה, אשר מחליפים 22 bp של רצף הגן המדווח המקורי. כדי לשחזר רצף זה, תיקון על-ידי HR משתמש בתבנית ההומולוגיה של 2.5 קילו-בסיס (kb) הממוקמת במורד הזרם של אקסון מסוף C.
תבנית קצרה HR: אתר ההגבלה הדרוש ליצירת DSB מחליף חלק מרצף הגן המקורי של המדווח ומציג קודון עצירה בתוך מסגרת. בדומה לגרסת התבנית הארוכה, מצע HR זה דורש את תבנית ההומולוגיה במורד הזרם (360 bp) לתיקון ושחזור מדויקים של ORF המדווח.
SSA: מצע זה מכיל קודון עצירה מוקדמת הממוקם בתוך אקסון N-terminal של הגן reporter. הסרת קודון עצירה זה והחזרת רצף הגן המדווח השלם דורשת תיקון על ידי SSA, הכולל כריתה דו-כיוונית לטווח ארוך לפני יישור ההומולוגיות.
עבור יצירת DSB, חלק ממצעי הכתב יכולים להיות מעוכלים באמצעות I-SceI (איור 1). זה ייצור מצע ליניארי עם קצוות לא מגובשים בכתבי MMEJ תלויי כריתה, NHEJ לא בוטה, תבנית ארוכה HR וכתבי SSA, שיש להם אתרי I-SceI בכיוונים הפוכים. בתבנית הקצרה מצע כתב משאבי אנוש, העיכול של אתר I-SceI היחיד ייצור קצוות מגובשים. ניתן לעכל גם את הפלסמידים הלא קהים של NHEJ, MMEJ תלוי כריתה, תבנית ארוכה HR ו- SSA עם HindIII, אשר יפיקו קצוות מלוכדים משלימים.
אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת מצעי בדיקת הכתב ומתארים כיצד ניתן לבצע את הבדיקות, מספקים פרטים על האופן שבו ניתן להשתמש בהם כדי לכמת DSBR, כולל תגובות titratable למולקולות קטנות, הערכת עוצמה תאית, פעילות על המטרה וסלקטיביות מסלול.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תיארנו פרוטוקולים ליצירה ויישום של חבילה של כתבים מבוססי לומינסנציה חוץ-כרומוזומלית למדידת המיומנות התאית של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים (HR, NHEJ, MMEJ ו-SSA)7. ניתן להחדיר מצעי כתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת ולהשתמש בהם כדי להעריך את פעילות DSBR באמצעות קריאה רגישה וחזקה מבוססת לוחות של זוהר NanoLuc, אשר משוחזרת עם מעורבות עם מסלולי DSBR תאיים קוגניטיביים.
מספר שלבים של יצירת מצע כתב, טרנספקציה של המצע לתאים ופירוש נתונים הם קריטיים לביצוע מוצלח של בדיקות אלה. למרות שטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות משמשות ליצירת מצעי הכתב, הדמיה של התהליך על ידי אלקטרופורזה בג’ל מבטיחה את האיכות והטוהר הגבוהים ביותר של המצעים לפני ההעברה. מכיוון שבדיקות אלה מסתמכות על טרנספקציה חולפת, חלים שיקולים משותפים לשיטות אלה. אלה כוללים אופטימיזציה של צפיפות הזריעה, תנאי טרנספקציה (כולל ריאגנטים וכמויות DNA), והערכת התאמה בפורמטים של טרנספקציה קדימה ואחורה. בדיקות כתבים אלה בוצעו בהצלחה עם מגוון פרוטוקולים של אלקטרופורציה וליפופקציה, ויש לבחון אפשרויות במלואן לפני ביצוע בדיקות אלה. כמו כן, יש להקפיד לבדוק את הרכיבים NanoLuc ואותות Firefly ולא רק את אות התיקון המרוכב הנגזר על ידי נרמול אות NanoLuc (מצע כתב) לאות Firefly (בקרה). ממצאים יכולים לנבוע מהיחס המונע על ידי שינויים באות הגחלילית. לדוגמה, הערכת עיכוב במצב מנה-תגובה באמצעות תרכובת ספציפית מאוד אמורה לדכא את אות ה-NanoLuc באופן טיטרטיבי מבלי להפריע לאות הגחלילית, שאמור להישאר יציב (איור 4G,H). אולם במקרים שבהם אותות הגחלילית מוטרדים, עדיין ניתן לקבוע השפעות שימושיות על התיקון על-ידי זיהוי חלון מינון שבו אות הגחלילית אינו מושפע (איור 5).
בהשוואה למבחני כתב DSBR הנפוצים ביותר, למבחני כתב חוץ-כרומוזומליים אלה המבוססים על לומינסנציה יש כמה יתרונות ברורים. מכיוון שמסלולי DSBR נשמרים מאוד, גם אם המנגנון התאי משתנה בין מודלים תאיים, הבדיקות עדיין יכולות לדווח על מיומנות DSBR ובחירת מסלולים. זה פותח את ההערכה של DSBR לכל מודל של עניין למשתמש, כל עוד תנאי transfection ארעיים אופטימליים נקבעים מראש.
השימוש בננולוציפראז כגן המדווח מציע גם יתרונות על פני אפשרויות פלואורסצנטיות, אשר שימשו באופן מסורתי במבחני כתב DSBR. NanoLuc מתבגר במהירות וזוהה ברגישות גבוהה באמצעות קורא לוחות8. יחד עם מהירות תיקון המצע (כאשר מצעי הכתב מועתקים לתאים עם קצוות DSB מוכנים לתיקון), פורמט זה של בדיקת כתב DSBR אידיאלי עבור התפנית המהירה והחוסן הכמותי הדרושים לסינון מולקולות קטנות כחלק ממפל גילוי תרופות תעשייתי. ואכן, לאחרונה תיארנו את יישום בדיקת כתב MMEJ הבלתי תלויה בכריתה במפל הגילוי המשמש לזיהוי מעכבי מולקולות קטנות בתחום Polθ polymerase13.
קיימת גם גמישות ביישום מבחני הכתב כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי הפרעות גנטיות ופרמקולוגיות של DSBR (איור 3). לדוגמה, לפני הטרנספקציה של מצעי הכתב, תאים יכולים להיות נגועים ב- siRNA כנגד גן מעניין למשך 48-72 שעות. לחלופין, ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר של גנים על מסלולי DSBR על ידי ביצוע טרנספקציית פלסמיד 24-48 שעות לפני הטרנספקציה של מצעים מדווחים. עבור מחקרים פרמקולוגיים, הפרוטוקול הנוכחי כבר מתאר כיצד ניתן לשלב את השימוש במולקולות קטנות בתהליך העבודה הסטנדרטי, אך פורמטים חלופיים עשויים לכלול שינויים במשטרי טיפול מורכבים, כגון טרום דגירות או שטיפות.
המדרגיות של טרנספקציה חולפת יכולה גם לתמוך בגישות סינון בקנה מידה גדול שבהן טרנספקציה אצווה של מצעי כתב מבוצעת לפני הסינון. יתר על כן, משך הבדיקה מטרנספקציה לקריאה יכול גם להיות מגוון. למרות משכי זמן סטנדרטיים עשויים להיות 16-24 שעות, כמה בדיקות ניתן לקרוא רק 6 שעות7. חששות לגבי רעילות ממולקולות קטנות או siRNA שיכולים לפגוע בכדאיות התא צריכים להילקח בחשבון גם בקביעת משך הבדיקה.
לסיכום, הבדיקות המתוארות במחקר זה ומתוארות במלואן בפרסום7 שפורסם לאחרונה מספקות הערכה מהירה וחזקה של מיומנות DSBR תאית. הם רגישים מאוד וניתנים לטיטרציה, מה שהופך אותם למקובלים על מחקרים גנטיים ופרמקולוגיים כאחד. באופן מכריע, מכיוון שניתן להכניס את מצעי הכתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת, יש להם פוטנציאל להיות מנוצלים בכל מודל תא טרנספקטיבי של עניין, במקום להיות מוגבלים לקווי תאים ספציפיים על ידי אינטגרציה יציבה כמו במקרה של כתבי DSBR כרומוזומליים. עם זאת, מגבלה ברורה של בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה היא שחוסר האינטגרציה בגנום עשוי שלא לשחזר באופן מלא את ההקשר הפיזיולוגי, הכרומטיני, של תיקון הדנ”א ואת רמזי הבקרה והתזמור הקשורים אליו15. לשם כך, מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים משלימים את השיטות הקיימות להערכת DSBR ומרחיבים את ארגז הכלים של המשאבים המתאימים הן למחקר בסיסי והן לגילוי תרופות.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל העבודה מומנה על-ידי Artios Pharma Ltd. איור 1 ואיור 3 נוצרו עם Biorender.com.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
参考文献
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
- Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
- Bvan de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
- Rajendra, E., et al. Quantitative, titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
- Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680.e9 (2022).
- Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
- Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
- Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847.e5 (2021).
- Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).
.