この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。
ヌクレオソームは真核生物のクロマチンの主要単位を構成し、その生物物理学的特性やクロマチン結合タンパク質との相互作用に関する数多くの有益な単一分子研究の焦点となっています。これらの研究のためのDNA上のヌクレオソーム再構成には、通常、DNAテザーに沿って形成されるヌクレオソームの配置と数を正確に制御する塩透析手順が含まれます。しかし、このプロトコールは時間がかかり、インプットとして大量のDNAとヒストン八量体が必要です。代替戦略として、ヒストンシャペロンNap1を利用した単一分子力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のための in situ ヌクレオソーム再構成法について説明する。この方法により、ユーザーは強力なヌクレオソームポジショニング配列を必要とせずに、任意のDNAテンプレート上にヌクレオソームをアセンブルし、ヌクレオソーム密度をオンデマンドで調整し、試薬の使用量を減らすことができます。 in situ ヌクレオソームの形成は数秒以内に行われるため、実験ワークフローが簡素化され、1分子測定への移行が容易になります。さらに、ヌクレオソームのメカニズムをプローブし、クロマチン上の個々のタンパク質の挙動を可視化するための2つのダウンストリームアッセイの例について説明します。
真核生物のクロマチンの主要なパッケージング単位はヌクレオソームであり、その中に~147塩基対(bps)のDNAがコアヒストンタンパク質1,2の八量体に巻き付けられています。ゲノムパッケージングに加えて、ヌクレオソーム構造は、クロマチン結合タンパク質がそのさまざまな機能を果たす際に利用できる生物物理学的調節の別の豊かな層として機能します3,4。ヌクレオソームの物理的特性に実験的にアクセスし、測定することは、これらのユニットが極小のスケール(ナノメートルの長さ、ピコニュートン力など)で動作するため、技術的に困難であり、したがって、それらのプローブには、機能に有意義な情報を提供するのに十分な感度と精度が必要です。さらに、クロマチン結合タンパク質はしばしばその基質と一過性に関与しており、ほとんどのアンサンブルアプローチは、これらの相互作用の動態を知らせるための適切な時間分解能を欠いています5。幸いなことに、単一分子技術の出現により、個々のタンパク質とその相互作用をリアルタイムで視覚化および操作することが可能になり、ナノスケールで発生するこれらの分子イベントに関するメカニズム情報が明らかになりました6。特に、1分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡(smCFFM)は、高分解能蛍光検出と力操作ツールの両方を利用して、クロマチンおよびクロマチン-タンパク質複合体の力学、組成、および配位を同時に分離します7,8。
力の操作方法として「光ピンセット」を特に採用しているsmCFFMでは、密集したレーザーを使用して、誘電体、通常はミクロンサイズのプラスチックビーズを3次元でトラップします9。DNA片のような生体高分子をビーズに結合させることができ(例えば、ストレプトアビジン−ビオチン、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体結合を介して)、ユーザーは、較正された力を加えることができ、かつ、システム10によって生成される力/変位を測定することができる。追加された蛍光モジュールにより、タンパク質の組成と挙動を追跡するためのマルチカラー蛍光イメージングを同時に行うことができます。
smCFFMのヌクレオソームテンプレートを再構成するための主流の方法は、塩透析11,12,13によってカスタムDNAテンプレート上にヌクレオソームを組み立てることを含む。この手順では、精製されたヒストン八量体を高塩緩衝液(~1M塩化ナトリウム)でDNAテンプレートと共にインキュベートし、塩がゆっくりと透析されると、ヌクレオソームは配列依存的な位置でDNA上に自発的に集合する14,15。そのため、強力なヌクレオソームポジショニング配列(例えば、Widom 60116、X. laevis 5S rDNA17)がDNAテンプレート内に組み込まれて、カスタムヌクレオソームアレイを生成するのが通例です。この確立された方法は、DNA上のヌクレオソームの配置と数を正確に制御することができますが、いくつかの欠点があります:(1)強力なヌクレオソームポジショニングDNA配列の組み込みは、クロマチン結合タンパク質の活性を偏らせる人工的に安定したヌクレオソームを生成する可能性があります、(2)ヌクレオソーム形成のための塩透析のプロセスには、大量のDNAとオクタマーが必要です。 (3)この手順は、最適なヌクレオソームアレイ密度を得るために正しいDNA対八量体比を滴定するために、1日から数日の作業とかなりの努力を要します。
本稿では、in vivo 18,19,20,21,22 のヌクレオソーム形成の生理経路に類似した組換えヒストンシャペロン Nap1 を用いて、単一分子相関力および蛍光顕微鏡を用いて、in situでDNAに沿ってヌクレオソームを形成する代替法について述べる.この方法により、ユーザーは非特異的なDNA配列上にヌクレオソームを組み立て、ヌクレオソーム密度を簡単に調整し、試薬の量を大幅に削減することができます。さらに、in situでヌクレオソームDNAテザーを形成することで、実験ワークフローが簡素化され、組み込み型の単一分子の可視化と操作の利便性が向上します。したがって、均一で特異的なヌクレオソームのポジショニングが必要ない場合、このプロトコルは、ヌクレオソームの力学やクロマチン上のタンパク質の挙動の調査に有用なオプションを提供します。
記載されたプロトコルは、ヌクレオソーム再構成のためのいくつかの利点を提供するだけでなく、試薬および時間の最小化、ならびに任意の(潜在的に天然の)DNA配列に沿ったシャペロン依存性ヌクレオソーム形成を可能にする。さらに、 in situ 法により、実験ワークフローが簡素化され、ヌクレオソーム力学およびタンパク質-クロマチン相互作用の単一分子ア…
The authors have nothing to disclose.
G. N. L. C. は、米国国立衛生研究所 (NIH) の国立精神衛生研究所からの支援を F31MH132306 件で認めています。S.L.は、ロバートソン財団、国際レット症候群財団、およびNIH(賞番号R01GM149862)の支援を受けています。
1x HR buffer | N/A | N/A | 30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA |
1x PBS (Phosphate-buffered saline) | N/A | N/A | 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic |
Acetic acid, glacial | Millipore Sigma | AX0074-6 | Use to make tris acetate |
Biotin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-BIOX-S | |
Biotin-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
Biotin-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9418-50G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye | Cytiva | PA23031 | Maleimide functionalized Cy3 fluorophore |
dGTP | New England Biolabs | N0442S | |
Eppendorf Centrifuge 5425 R | Fisher Scientific | 05-414-051 | Benchtop centrifuge with cooling |
Ethyl alcohol, Pure | Millipore Sigma | 459844 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | E9884 | Dissolve in H2O to 0.5 M |
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) | N/A | N/A | Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). |
Image buffer | N/A | N/A | 20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride |
Klenow Fragment (3' to 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
Lambda DNA (dam-, dcm-) | Thermo Fisher Scientific | SD0021 | Methylation-free λ DNA |
LD655-MAL | Lumidyne Technologies | 9 | Maleimide functionalized LD655 fluorophore |
Linker histone H1.4 (A4C) | N/A | N/A | Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38) |
LUMICKS C-Trap Dymo | LUMICKS | N/A | Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer |
Magnesium acetate solution | Millipore Sigma | 63052-100ML | Use to make HR buffer |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Included with Klenow Fragment kit |
Pluronic F-127 | Millipore Sigma | P2443-250G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P3911 | Use to make PBS and HR buffer |
Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | Use to make PBS |
S. cerevisiae Nap1 | N/A | N/A | Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif). |
Sodium acetate | Millipore Sigma | 241245 | Dissolve in H2O to 3 M |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | Use to make PBS and image buffer |
Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | S9763 | Use to make PBS |
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm) | Spherotech | TP-30-5 | |
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Fisher Scientific | ND2000 | NanoDrop Spectrophotometer |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate |