Computergestützte Vorhersage der Aminosäurepräferenzen potenziell multispezifischer Peptidbindungsdomänen, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind

Die Interaktion zwischen zwei Proteinen beinhaltet oft die Bindung kurzer Segmente von Aminosäuren an Peptid-Bindungsdomänen, die Protein-Peptid-Grenzflächen ähneln. Rezeptorproteine, die an solchen Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) beteiligt sind, haben oft die Fähigkeit, einen bestimmten Satz überlappender, aber divergierender Ligandensequenzen zu erkennen, eine Eigenschaft, die als Multispezifität bekannt ist ^1,2. Die multispezifische Erkennung ist ein Merkmal vieler zellulärer Proteine, aber besonders bemerkenswert ist sie bei Enzymen und zellulären Signalproteinen³. Proteine, die mit multispezifischen Bindungsstellen interagieren, haben oft eine Kombination aus mehr und weniger konservierten Regionen in ihrer Sequenz ^4,5,6. In diesem Szenario sind die stärker konservierten Sequenzmotive an stringenten molekularen Wechselwirkungen beteiligt. Umgekehrt interagieren die variableren Sequenzen mit irgendwie permissiven Oberflächen in der Rezeptorbindungsstelle. In der Regel handelt es sich bei diesen weniger konservierten, aber immer noch funktionell relevanten Segmenten um Schleifen ohne definierte Sekundärstrukturmuster oder um noch dynamischere Konformationen, wie sie für intrinsisch ungeordnete Proteine typisch sind⁷.

Die Identifizierung potenzieller Peptidliganden von Bindungsstellen ist in der Regel der erste Schritt bei der Entwicklung von Mediatoren, die in der Lage sind, die entsprechenden PPIs zu interferieren⁸. Es ist jedoch oft unwahrscheinlich, einen einzigen der häufigsten Aminosäurereste an den meisten Sequenzpositionen in Liganden multispezifischer Bindungsstellen zu finden. Stattdessen können diese Stellen besondere Präferenzen für eine bestimmte Klasse von Aminosäuren entsprechend ihren chemischen Eigenschaften haben, z. B. saure und negativ geladene Aminosäuren wie Aspartat oder Glutamat, sperrige aromatische Aminosäuren wie Phenylalanin oder mehr hydrophobe Reste wie aliphatische Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin³. Verschiedene experimentelle Methoden können Einblicke in die Aminosäurepräferenzen von Proteinbindungsstellen liefern, darunter die gerichtete Evolution⁹, die Multicodon-Scanning-Mutagenese¹⁰ und die tiefe^{Mutations-Scanning 11}. Alle diese Methoden folgen dem Ansatz der Sequenzdiversifizierung, der darauf basiert, Mutationen in ursprüngliche Liganden einzuführen und deren Wirkung auf die Funktion des Rezeptorproteins weiter zu analysieren (siehe Bratulic und Badran¹² für eine umfassende Übersicht). Diese Methoden erfordern jedoch oft die Durchsicht großer Sequenzbibliotheken, was sie umständlicher, kostspieliger und zeitaufwändiger macht.

Computergestützte Methoden zur Ableitung der Aminosäurepräferenzen multispezifischer Bindungsstellen haben das Potenzial, die Einschränkungen von Nasslabormethoden zu umgehen. Unter diesen bewertet der In-silico-Sequenzdiversifikationsansatz den energetischen Einfluss einer Vielzahl von Aminosäureersatzstoffen in der Ligandensequenz, um die strukturelle Plastizität des PPI¹³ zu charakterisieren. Diese Methode beginnt mit der Struktur oder dem Modell des Peptidliganden, der an die Rezeptorbindungsstelle gebunden ist, und führt anschließend Mutationen in die Ligandensequenz ein. Statistische und Energie-Scoring-Funktionen werden dann verwendet, um den Einfluss dieser Mutationen auf die Stabilität und Bindungsaffinität zu bewerten. Der Satz der Ligandensequenzen mit der besten Punktzahl, der sich aus der Evaluierungsphase ergibt, kann dann zur Berechnung der Aminosäurepräferenzen verwendet werden. Diese Strategie hat das Potenzial, eine sehr große Anzahl von Ligandensequenzen effizient zu verarbeiten. Daher kann es eine vollständigere und konsistentere Rückschluss auf die Aminosäurepräferenzen liefern, verglichen mit denen, die aus der begrenzteren Anzahl von Sequenzen berechnet werden, die normalerweise in Nasslaboransätzen verarbeitet werden können.

Die Pepspec-Anwendung der Rosetta Molecular Modeling Suite¹⁴ ist ein Werkzeug, das die Sequenzdiversifizierung als wichtigen Schritt seines Peptiddesignmodus durchführt. Diese Anwendung erfordert eine Struktur oder ein Modell des Rezeptorproteins mit einem gebundenen Peptid bis zu einem einzigen Aminosäurerest in der Länge, das als Anker für die nächsten Schritte verwendet wird. Die Sequenz des gebundenen Peptids wird dann (falls erforderlich) verlängert und diversifiziert, um eine große Anzahl von mutmaßlichen Peptidliganden zu erzeugen. Die Bindungsaffinität dieser Peptide wird dann durch Peptid-Docking mit flexiblem Rückgrat bewertet, um diejenigen mit den besten vorhergesagten Bindungswerten auszuwählen. Obwohl das Hauptergebnis dieser Anwendung die besten Peptidkandidaten sind, die am Ende der Designphase ausgewählt werden, kann die viel größere Menge von Peptiden, die in dieser Phase akzeptiert werden, auch zur Berechnung der Aminosäurepräferenzen der Zielbindungsstelle verwendet werden. Aminosäurepräferenzen werden als Häufigkeit jedes Aminosäurerests pro Position der Ligandensequenz berechnet, die entweder als Positionsgewichtsmatrix (PWM) oder als visuelleres Sequenzlogo dargestellt wird.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Abschätzung der Aminosäurepräferenzen der Bindungsoberfläche eines Rezeptorproteins, das an einem PPI beteiligt ist. Das Protokoll konzentriert sich auf PPIs, bei denen bekannt ist, dass ein lineares Segment des Protein-Liganden an das Rezeptorprotein bindet, so dass das Szenario als Protein-Peptid-Schnittstelle modelliert werden kann. In diesem Szenario interagieren konservierte Motive aus dem Liganden typischerweise mit definierten Taschen in der Rezeptorbindungsstelle, obwohl das gesamte Ligandensegment, das an der PPI beteiligt ist, weniger konservierte Regionen enthalten kann. Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammenfasst, ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll beginnt mit der 3D-Struktur des Protein-Protein-Komplexes und reduziert das Ligandenprotein weiter auf das potenziell am besten interagierende Segment, wobei das Rezeptorprotein intakt bleibt. Das am besten interagierende Segment wird unter Verwendung des BUDE Alanin-Scan-Servers¹⁵ abgeleitet, der eine rechnergestützte Alanin-Scanning-Mutagenese durchführt, um Hot-Spot-Reste zwischen den beiden interagierenden Proteinen zu identifizieren. Bei diesem Ansatz werden Reste aus dem Liganden einzeln durch Alanin ersetzt, und die geschätzte Änderung der freien Energie oder Stabilität des Komplexes (ΔΔG) wird dann verwendet, um auf die Relevanz des entsprechenden Rests für den Ziel-PPI zu schließen. Sobald das am besten interagierende Segment abgeleitet ist, wird sein Komplex mit dem Rezeptorprotein als Basisstruktur verwendet, die an Pepspec übermittelt wird, um eine Sequenzdiversifizierung durchzuführen.

Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Schritte des Protokolls, das in dieser Arbeit vorgeschlagen wird. Die Nummern stimmen mit den Schrittnummern im Protokollabschnitt überein. Die Abbildungen wurden mit dem Protein-Protein-Komplex erstellt, der als Beispiel für das im Text beschriebene Beispiel verwendet wird. In diesem Komplex ist die Proteinkette, die als Rezeptor betrachtet wird, rosa dargestellt, während die Kette, die als Ligand betrachtet wird, in hellblau dargestellt ist, wobei ihr vorhergesagtes Segment mit der besten Wechselwirkung rot hervorgehoben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Eine der Einschränkungen des vorgeschlagenen Protokolls ist die Anforderung einer aufgelösten Struktur der Protein-Peptid-Grenzfläche. Das Protokoll kann alternativ mit einem Modell der Zielprotein-Peptid-Grenzfläche beginnen, obwohl die spezifischen Modellierungsschritte hier nicht beschrieben werden. Obwohl das Protokoll auf einem PC mit einem beliebigen Betriebssystem ausgeführt werden kann, ist für die Schritte mit den Rosetta-Anwendungen eine Linux-Umgebung erforderlich. Ein Computercluster wird auch für den Schritt der Sequenzdiversifizierung dringend empfohlen, da Pepspec typischerweise eine große Anzahl von Iterationen durchführt.

Die Anwendung des vorgeschlagenen Protokolls wird durch die Schätzung der Aminosäurepräferenzen der Gebotsfläche von IRF5, einem Mitglied der Familie der humanen Interferon-Regulationsfaktoren (IRF), veranschaulicht. Wir haben dieses Protein als Beispiel gewählt, weil sich während seiner Aktivierung zwei Untereinheiten zu einem Dimer verbinden, dessen Struktur gut charakterisiert ist¹⁶. In IRF-Dimeren kann die Bindung als Protein-Peptid-Grenzfläche modelliert werden, bei der eine Untereinheit die Bindungsoberfläche bildet und die andere durch eine Region interagiert, die ein kurzes konserviertes Motiv namens pLxIS^17,18 enthält. Darüber hinaus ist die Bindung an IRF-Untereinheiten multispezifisch; Daher können sie Homodimere, Heterodimere und Komplexe mit anderen zellulären Proteinen bilden, die als Koaktivatoren bekannt sind¹⁸.