חיזוי חישובי של העדפות חומצות אמינו של תחומים קושרי פפטיד רב-ספציפיים המעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון

אינטראקציה בין שני חלבונים כרוכה לעתים קרובות בקשירה של מקטעים קצרים של חומצות אמינו לתחומים קושרי פפטידים, הדומים לממשקים חלבון-פפטידים. חלבוני קולטן המעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון כאלה (PPI) מסוגלים לעתים קרובות לזהות קבוצה מסוימת של רצפי ליגנדים חופפים אך מסתעפים, תכונה הידועה בשם רב-ספציפיות ^1,2. זיהוי רב-ספציפי הוא תכונה של חלבונים תאיים רבים, אך הוא יוצא דופן במיוחד באנזימים ובחלבוני איתות תאי³. חלבונים המקיימים אינטראקציה עם אתרי קשירה רב-ספציפיים מכילים לעתים קרובות שילוב של אזורים שמורים יותר ופחות ברצף שלהם ^4,5,6. בתרחיש זה, מוטיבים רצפים שמורים יותר מעורבים באינטראקציות מולקולריות מחמירות. לעומת זאת, הרצפים המשתנים יותר מתקשרים עם משטחים מתירניים איכשהו באתר קשירת הקולטן. בדרך כלל, מקטעים פחות שמורים אלה אך עדיין רלוונטיים מבחינה תפקודית הם לולאות חסרות תבניות מבנה משניות מוגדרות או בעלות קונפורמציות דינמיות עוד יותר, כגון אלה האופייניות לחלבונים בעלי הפרעה פנימית⁷.

זיהוי ליגנדות פפטידים פוטנציאליות של אתרי קשירה הוא בדרך כלל הצעד הראשון בתכנון מתווכים המסוגלים להפריע ל- PPIs⁸ המתאימים. עם זאת, לעתים קרובות לא סביר למצוא שארית אחת של חומצות אמינו שכיחות ביותר ברוב מיקומי הרצף בליגנדות של אתרי קישור רב-ספציפיים. במקום זאת, אתרים אלה עשויים להיות העדפות מיוחדות עבור סוג מסוים של חומצות אמינו על פי התכונות הכימיות שלהם, למשל, חומצות אמינו חומציות טעונות שלילית כגון אספרטט או גלוטמט, חומצות אמינו ארומטיות מגושמות כגון פנילאלנין או שאריות הידרופוביות יותר כגון חומצות אמינו אליפטיות אלנין, ואלין, לאוצין או איזולאוצין³. מספר שיטות ניסוי יכולות לספק תובנות לגבי העדפות חומצות אמינו של אתרי קשירת חלבונים, כולל אבולוציה מכוונת⁹, מוטגנזה של סריקה מרובת קודונים¹⁰ וסריקה מוטציונית עמוקה¹¹. כל השיטות הללו נוקטות בגישה של גיוון רצפים, המבוססת על החדרת מוטציות לליגנדות המקוריות וניתוח נוסף של השפעתן על תפקוד חלבון הקולטן (ראו Bratulic and Badran¹² לסקירה מקיפה). עם זאת, שיטות אלה דורשות לעתים קרובות סקר של ספריות רצפים גדולות, מה שהופך אותן למסורבלות, יקרות וגוזלות זמן רב יותר.

לשיטות חישוביות להסיק את העדפות חומצות האמינו של אתרי קישור רב-ספציפיים יש פוטנציאל לעקוף את המגבלות של שיטות מעבדה רטובות. בין אלה, גישת גיוון רצף הסיליקו מעריכה את ההשפעה האנרגטית של מגוון רחב של תחליפי חומצות אמינו ברצף הליגנד כדרך לאפיין את הפלסטיות המבנית של PPI¹³. שיטה זו מתחילה במבנה או במודל של ליגנד הפפטיד הקשור לאתר קשירת הקולטן ולאחר מכן מציגה מוטציות לרצף הליגנד. פונקציות סטטיסטיות וניקוד אנרגיה משמשות לאחר מכן כדי להעריך את ההשפעה של מוטציות אלה על יציבות וזיקה קשירה. לאחר מכן ניתן להשתמש בקבוצת רצפי הליגנד בעלי הניקוד הטוב ביותר הנובעים משלב ההערכה כדי לחשב את העדפות חומצות האמינו. לאסטרטגיה זו יש פוטנציאל לעבד מספר גבוה מאוד של רצפי ליגנדים בצורה יעילה. לכן, הוא יכול לספק הסקה מלאה ועקבית יותר של העדפות חומצות אמינו בהשוואה לאלה המחושבות ממספר מצומצם יותר של רצפים שבדרך כלל ניתן לעבד בגישות מעבדה רטובות.

יישום Pepspec של Rosetta molecular modeling suite¹⁴ הוא כלי המבצע גיוון רצף כשלב מפתח במצב העיצוב הפפטידי שלו. יישום זה דורש מבנה או מודל של חלבון הקולטן עם פפטיד קשור עד לשארית חומצת אמינו בודדת באורך, אשר משמש כעוגן לשלבים הבאים. לאחר מכן מרחיבים את רצף הפפטיד הכבול (במידת הצורך) ומגוונים אותו כדי ליצור מספר רב של ליגנדות פפטידיות משוערות. זיקת הקשירה של פפטידים אלה מוערכת לאחר מכן על ידי עגינה פפטידית גמישה בעמוד השדרה על מנת לבחור את אלה עם ציוני הקשירה החזויים הטובים ביותר. למרות שהפלט העיקרי של יישום זה הוא המועמדים הפפטידים הטובים ביותר שנבחרו בסוף שלב התכנון, ניתן להשתמש בקבוצה הגדולה בהרבה של פפטידים שהתקבלה בשלב זה גם כדי לחשב את העדפות חומצות האמינו של אתר קשירת המטרה. העדפות חומצות אמינו מחושבות כתדירות של כל שארית חומצת אמינו לכל מיקום של רצף הליגנד המיוצג כמטריצת משקל מיקום (PWM) או כלוגו של רצף חזותי יותר.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול להערכת העדפות חומצות האמינו של משטח הקישור של חלבון קולטן המעורב ב- PPI. הפרוטוקול מתמקד ב-PPIs שבהם ידוע שמקטע ליניארי של ליגנד החלבונים נקשר לחלבון הקולטן, כך שניתן למדל את התרחיש כממשק חלבון-פפטידי. בתרחיש זה, מוטיבים שמורים מהליגנד מתקשרים בדרך כלל עם כיסים מוגדרים באתר קשירת הקולטן, אם כי כל מקטע הליגנד המעורב ב- PPI עשוי להכיל אזורים פחות שמורים. תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול מוצג באיור 1. הפרוטוקול מתחיל במבנה התלת-ממדי של קומפלקס החלבון-חלבון ומפחית עוד יותר את חלבון הליגנד למקטע הפוטנציאלי בעל האינטראקציה הטובה ביותר, ומשאיר את חלבון הקולטן שלם. המקטע בעל האינטראקציה הטובה ביותר מוסק על ידי שימוש בשרת BUDE Alanine Scan¹⁵, המבצע מוטגנזה חישובית של סריקת אלנין כדי לזהות שאריות של נקודות חמות בין שני החלבונים המקיימים אינטראקציה. בגישה זו, שאריות מהליגנד מוחלפות בנפרד באלנין, והשינוי המשוער באנרגיה החופשית או ביציבות של הקומפלקס (ΔΔG) משמש לאחר מכן כדי להסיק את הרלוונטיות של השאריות המתאימות עבור PPI המטרה. לאחר הסקת המקטע בעל האינטראקציה הטובה ביותר, הקומפלקס שלו עם חלבון הקולטן משמש כמבנה הבסיס שהוגש לפפספקט לביצוע גיוון רצפים.

איור 1: סקירה כללית של השלבים העיקריים של הפרוטוקול המוצע בעבודה זו. המספרים תואמים למספרי השלבים במקטע הפרוטוקול. האיורים נעשו עם קומפלקס חלבון-חלבון המשמש כדוגמה המתוארת בטקסט. בקומפלקס זה, שרשרת החלבונים הנחשבת לקולטן מוצגת בוורוד, בעוד שהשרשרת הנחשבת לליגנד מוצגת בכחול בהיר כאשר המקטע החזוי בעל האינטראקציה הטובה ביותר מודגש באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אחת המגבלות של הפרוטוקול המוצע היא הדרישה למבנה פתור של ממשק חלבון-פפטיד . לחלופין, הפרוטוקול עשוי להתחיל במודל של ממשק חלבון-פפטיד מטרה, אם כי שלבי המידול הספציפיים אינם מתוארים כאן. יתר על כן, למרות שניתן לנהל את הפרוטוקול במחשב אישי המריץ כל מערכת הפעלה, נדרשת סביבת לינוקס לשלבים המערבים את יישומי רוזטה. אשכול מחשבים מומלץ מאוד גם לשלב גיוון הרצף בשל המספר הגדול של חזרות המבוצעות בדרך כלל על ידי Pepspec.

יישום הפרוטוקול המוצע מומחש באמצעות הערכת העדפות חומצות אמינו של משטח המכרז של IRF5, חבר במשפחת הגורמים הרגולטוריים אינטרפרון אנושיים (IRF). בחרנו בחלבון זה כדוגמה, משום שבמהלך הפעלתו, שתי תת-יחידות נקשרות ליצירת דימר שמבנהו מאופיין היטב¹⁶. בדימרים IRF, ניתן למדל קשירה כממשק חלבון-פפטידי שבו תת-יחידה אחת מספקת את משטח הקישור והשנייה מתקשרת דרך אזור המכיל מוטיב שימור קצר הנקרא pLxIS^17,18. בנוסף, כריכה ליחידות משנה IRF היא רב-ספציפית; לכן, הם יכולים ליצור הומודימרים, הטרודימרים וקומפלקסים עם חלבונים תאיים אחרים המכונים קו-אקטיבטורים¹⁸.