Messung der Poly-A-Schwanzlänge aus Drosophila-Larvengehirn und Zelllinien

Die meisten eukaryotischen mRNAs werden an ihrem 3′-Terminus im Zellkern durch Zugabe von nicht-template-Adenosinen durch kanonische Poly(A)-Polymerasen posttranskriptionell polyadenyliert. Ein intakter Poly(A)-Schwanz ist während des gesamten Lebenszyklus von mRNA von entscheidender Bedeutung, da er für den mRNA-Kernexport^{unerlässlich ist 1}, die Interaktion mit Poly(A)-bindenden Proteinen erleichtert, um die Translationseffizienz zu verbessern², und Resistenz gegen Abbau^{verleiht 3}. In bestimmten Fällen kann der Poly(A)-Schwanz auch im Zytoplasma gedehnt werden, was durch nicht-kanonische Poly(A)-Polymerasen erleichtert wird⁴. Im Zytoplasma ändert sich die Poly(A)-Schwanzlänge dynamisch und beeinflusst die Lebensdauer des mRNA-Moleküls. Zahlreiche Polymerasen und Deadenylasen sind dafür bekannt, die Schwanzlänge zu modulieren ^5,6,7. Zum Beispiel korreliert die Verkürzung der Poly(A)-Schwänze mit der translationalen Repression, während die Verlängerung der Poly(A)-Schwänze die Translation verstärkt ^8,9.

Zunehmende genomische Studien haben die grundlegende Bedeutung der Poly(A)-Schwanzlänge in verschiedenen Facetten der eukaryotischen Biologie gezeigt. Dazu gehören Rollen bei der Keimzellentwicklung, der frühen Embryonalentwicklung, der neuronalen synaptischen Plastizität für Lernen und Gedächtnis und der Entzündungsreaktion¹⁰. Es wurden zahlreiche Methoden und Assays zur Messung von Poly(A)-Schwanzlängen entwickelt. Beispielsweise nutzt der RNase H/Oligo(dT)-Assay die Vorteile von RNase H in Gegenwart oder Abwesenheit von Oligo(dT), um die Poly(A)-Schwanzlänge zu untersuchen^11,12. Andere Methoden zur Untersuchung des Poly(A)-Schwanzes umfassen die PCR-Amplifikation von 3′-Enden, wie z. B. die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, den Poly(A)-Test (RACE-PAT)^12,13 und den Ligase-vermittelten Poly(A)-Test (LM-PAT)¹⁴. Weitere Modifikationen des PAT-Assays umfassen ePAT¹⁵ und sPAT¹⁶. Enzymatisches G-Tailing ^17,18 oder G/I-Tailing des 3′-Endes sind weitere Variationen des PAT-Assays. Eine weitere Modifikation dieser Techniken umfasst die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern zusammen mit einer Kapillargelelektrophorese für hochauflösende Analysen, die als hochauflösender Poly(A)-Test (Hire-PAT)¹⁹ bezeichnet wird. Diese PCR-gesteuerten Assays ermöglichen eine schnelle und hochempfindliche Quantifizierung der Poly(A)-Länge.

Mit der Entwicklung der Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode wie PAL-seq²⁰ und TAIL-seq²¹ Polyadenylierungsanalysen im transkriptomweiten Maßstab. Diese Methoden liefern jedoch nur kurze Sequenzierungs-Reads von 36-51 Nukleotiden. Daher wurde FLAM-Seq²² für die globale Schwanzlängenprofilierung von mRNA in voller Länge entwickelt und bietet lange Lesevorgänge. Die Nanoporentechnologie²³ bietet PCR-unabhängige, direkte RNA- oder direkte cDNA-Sequenzierung für die Schätzung der Poly(A)-Schwanzlänge. Diese Hochdurchsatzmethoden sind jedoch nicht ohne Einschränkungen. Sie benötigen große Mengen an Ausgangsmaterialien, sind teuer und zeitaufwändig. Darüber hinaus kann die Analyse seltener Transkripte mit Hochdurchsatzmethoden äußerst anspruchsvoll sein, und PCR-basierte Methoden mit niedrigem Durchsatz bieten immer noch einen Vorteil, wenn eine kleine Anzahl von Transkripten analysiert werden muss, für Pilotexperimente und die Validierung anderer Methoden.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Dscam1-mRNAs kurze Poly(A)-Schwänze in Drosophila enthalten, was eine nicht-kanonische Bindung des zytoplasmatischen Poly(A)-bindenden Proteins an Dscam1 3’UTR unter Verwendung der G/I-Tailing-Methode²⁴ erfordert. Hier bieten wir ein optimiertes Verfahren zur Gewebepräparation und Quantifizierung der Poly(A)-Länge von mRNAs aus dem Drosophila-Nervensystem und Drosophila-S2-Zellen .