Drosophila Larva Brain and Cell Line의 Poly A 꼬리 길이 측정
概要
이 프로토콜은 다른 종의 조직이나 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있는 초파리 신경계의 관심 유전자의 폴리(A) 길이를 정량화하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.
Abstract
폴리아데닐화(Polyadenylation)는 mRNA 분자의 3′ 말단에 폴리(A) 꼬리를 추가하는 중요한 전사 후 변형입니다. 폴리(A) 꼬리의 길이는 세포 과정에 의해 엄격하게 조절됩니다. mRNA 폴리아데닐화의 조절 장애는 비정상적인 유전자 발현 및 암, 신경 장애 및 발달 이상을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다. 따라서 폴리아데닐화의 역학을 이해하는 것은 mRNA 처리 및 전사 후 유전자 조절의 복잡성을 밝히는 데 매우 중요합니다.
이 논문은 초파리 유충 뇌와 초파리 슈나이더 S2 세포에서 분리된 RNA 샘플에서 폴리(A) 꼬리 길이를 측정하는 방법을 제시합니다. 우리는 효모 폴리(A) 중합효소를 사용하여 mRNA의 3′ 말단에 G/I 잔기를 효소로 추가하는 구아노신/이노신(G/I) 테일링 접근법을 사용했습니다. 이 변형은 RNA의 3′ 말단을 효소 분해로부터 보호합니다. 그런 다음 보호된 전체 길이 폴리(A) 꼬리는 범용 안티센스 프라이머를 사용하여 역전사됩니다. 이어서, PCR 증폭은 역전사에 사용되는 범용 서열 올리고와 함께 관심 유전자를 표적으로 하는 유전자 특이적 올리고를 사용하여 수행됩니다.
이것은 관심 유전자의 폴리(A) 꼬리를 포함하는 PCR 산물을 생성합니다. 폴리아데닐화는 균일한 변형이 아니고 다양한 길이의 꼬리가 생기기 때문에 PCR 산물은 다양한 크기를 표시하여 아가로스 겔에 얼룩 패턴을 유발합니다. 마지막으로, PCR 산물은 고분해능 모세관 겔 전기영동을 거친 후 폴리(A) PCR 산물 및 유전자 특이적 PCR 산물의 크기를 사용하여 정량화합니다. 이 기술은 폴리(A) 꼬리 길이를 분석하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하여 mRNA 조절을 지배하는 복잡한 메커니즘에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다.
Introduction
대부분의 진핵생물 mRNA는 canonical poly(A) polymerases에 의한 non-templated 아데노신의 첨가에 의해 핵의 3′ 말단에서 전사 후 폴리아데닐화됩니다. 온전한 poly(A) tail은 mRNA핵 내보내기에 필수적이고1, poly(A)-결합 단백질과의 상호작용을 촉진하여 번역 효율을 높이고2, 분해에 대한 저항성을 부여하기 때문에 mRNA의 수명 주기 전반에 걸쳐 중추적인 역할을합니다3. 어떤 경우에는 poly(A) 꼬리가 세포질에서 확장될 수도 있는데, 이는 noncanonical poly(A) polymerases4에 의해 촉진된다. 세포질에서 폴리(A) 꼬리 길이는 동적으로 변화하고 mRNA 분자의 수명에 영향을 미칩니다. 수많은 폴리메라이제와 데데닐라아제는 꼬리 길이 5,6,7을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, poly(A) 꼬리의 짧아짐은 translational repression과 상관관계가 있는 반면, poly(A) tails의 길어지는 것은 translation 8,9를 향상시킵니다.
축적된 게놈 연구는 진핵생물 생물학의 다양한 측면에 걸쳐 폴리(A) 꼬리 길이의 근본적인 중요성을 입증했습니다. 여기에는 생식세포 발달, 초기 배아 발달, 학습 및 기억을 위한 신경 시냅스 가소성, 염증 반응10에서의 역할이 포함된다. 폴리(A) 꼬리 길이를 측정하기 위해 개발된 수많은 방법과 분석법이 있습니다. 예를 들어, RNase H/oligo(dT) 분석은 oligo(dT)의 존재 또는 부재에서 RNase H를 활용하여 poly(A) 꼬리 길이11,12를 연구합니다. 폴리(A) 꼬리를 연구하는 다른 방법으로는 cDNA 말단의 빠른 증폭과 같은 3′ 말단의 PCR 증폭, 폴리(A) 테스트(RACE-PAT)12,13 및 리가아제 매개 폴리(A) 테스트(LM-PAT)14가 있습니다. PAT 분석의 추가 변형에는 ePAT15 및 sPAT16이 포함됩니다. 효소 G-테일링17,18 또는 3′ 말단의 G/I-테일링은 PAT 분석의 다른 변형입니다. 이러한 기법의 추가 수정에는 고분해능 폴리(A) 테스트(Hire-PAT)19라고 하는 고분해능 분석을 위한 모세관 겔 전기영동과 함께 형광 표지 프라이머의 사용이 포함됩니다. 이러한 PCR 기반 분석은 빠르고 감도가 높은 폴리(A) 길이 정량을 가능하게 합니다.
차세대 염기서열분석법의 개발로 PAL-seq20 및 TAIL-seq21과 같은 고처리량 염기서열분석법을 통해 전사체 전체 규모에서 폴리아데닐화 분석이 가능합니다. 그러나 이러한 방법은 36-51 뉴클레오티드의 짧은 염기서열분석 판독만을 제공합니다. 따라서 FLAM-Seq22 는 full-length mRNA의 global tail length profiling을 위해 개발되었으며 긴 판독을 제공합니다. 나노포어 기술(23 )은 폴리(A) 꼬리 길이 추정을 위해 PCR 독립적, 직접 RNA 또는 직접 cDNA 시퀀싱을 제공합니다. 그러나 이러한 고처리량 방법에 제한이 없는 것은 아닙니다. 많은 양의 출발 물질이 필요하고 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 또한, 고처리량 분석법에서는 희귀 전사체 분석이 매우 어려울 수 있으며, 저처리량 PCR 기반 분석법은 파일럿 실험 및 다른 분석법의 검증을 위해 소수의 전사체를 분석해야 하는 경우에도 여전히 이점을 제공합니다.
우리는 최근 Dscam1 mRNA가 초파리에 짧은 폴리(A) 꼬리를 포함한다는 것을 입증했으며, 이는 G/I 테일링 방법24를 사용하여 Dscam1 3’UTR에서 세포질 폴리(A) 결합 단백질의 비표준 결합을 필요로 합니다. 여기서는 조직 준비 및 초파리 신경계 및 초파리 S2 세포의 mRNA의 폴리(A) 길이를 정량화하기 위한 간소화된 절차를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서는 방황하는 3번째 instar 단계에서 초파리 유충 뇌를 해부하는 기술과 초파리 S2 세포의 샘플 준비에 대해 설명합니다. mRNA의 불안정한 특성으로 인해 검체 채취에는 각별한 주의가 필요합니다. 유충 뇌 해부의 경우 격리 중에 뇌가 손상되어서는 안 되며 장기간 용액에 보관해서는 안 됩니다. 해부 라운드를 위해 해부 시간을 8-10분으로 유지하는 것이 필수적입?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 J.K.에 R01NS116463 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant )와 국립 보건원(National Institutes of Health)의 P20GM103650보조금을 지원받아 이 연구에서 보고된 연구에 사용된 리노 네바다 대학교(University of Nevada, Reno)의 세포 및 분자 이미징 핵심 시설(Cellular and Molecular Imaging Core facility)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
参考文献
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
