이 프로토콜은 파킨슨병의 알파 시누클레인 기반 초파리 모델에서 변비를 모델링하기 위한 분석을 제시합니다.
파킨슨병(PD)의 비운동 증상은 흔하고 치료가 어려우며 삶의 질을 크게 떨어뜨립니다. 흔한 비운동 증상 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 진단보다 수년 또는 수십 년 앞설 수 있습니다. 변비는 PD의 동물 모델에서 충분히 연구되지 않았으며 특별한 치료법이 부족합니다. 이 분석실험은 PD의 초파리 모형을 이용합니다 인간 알파 synuclein가 pan 신경 운전사의 밑에 표현되는 곳. 알파 synuclein를 표현하는 파리는 PD의 특징을 개발합니다: 도파민성 신경 세포의 손실, 운동 손상 및 알파 synuclein 포함.
이 프로토콜은 이 파리의 변비를 연구하는 방법을 설명합니다. 파리는 밤새 파란색 첨가물이 첨가된 플라이 사료에 넣은 다음 다음날 표준 사료로 옮깁니다. 그런 다음 8시간 동안 매시간 표준 플라이 푸드가 있는 새 바이알로 옮겨집니다. 각 이식 전에 바이알 벽의 총 분변 반점 대비 파란색 분변 반점의 비율이 계산됩니다. 알파 시누클레인이 결핍된 대조군은 알파 시누클레인을 발현하는 파리가 생기기 전에 모든 청색 염료를 배출합니다. 또한 장에서 파란색 음식물이 통과하는 것을 간단한 사진으로 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법의 단순성으로 인해 전방 유전 또는 화학 스크리닝에서 초파리의 변비 조절 인자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
파킨슨병(Parkinson’s disease, PD)은 진행성 신경퇴행성 질환으로, 서동, 경직, 떨림과 같은 운동 증상이 임상적으로 나타나 상당한 이환율을 초래한다1. 병리학적으로, PD는 흑질에 있는 도파민 신경 세포의 손실 및 알파 synuclein의 misfolding에 의해 정의되, Lewy 몸 및 Lewy neurites의 대형으로 이끌어 내. 파킨슨병의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않은데, 이는 유전적 요인과 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 기인하는 것으로 보인다 2,3. 현재로서는 질병 수정 요법을 사용할 수 없으며, 이는 부분적으로 진단 당시 병리학의 진행된 단계 때문일 수 있습니다. 연구에 따르면 흑질에 있는 도파민 뉴런의 60% 이상이 운동 증상의 시작으로 이미 소실된 것으로 나타났으며, 이는 질병 조기 발견을 위한 잠재적인 바이오마커를 탐색해야 할 필요성을 강조합니다4. 이러한 임상적 바이오마커 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 환자에서 흔히 발생하며5,6 운동 증상 발현보다 수년 또는 수십 년 전에 나타날 수 있다.
운동 증상에 근거한 복막투석의 임상적 정의에도 불구하고, 변비는 증상적으로 치료하기 어렵고 환자의 삶의 질에 심각한 손상을 초래하는 여러 비운동 증상 중 하나이다7. 뇌와 장 신경계 사이의 양방향 통신을 나타내는 장-뇌 축의 변화는 PD 발병과 관련이 있습니다. 알파-시누클레인 응집체는PD 환자8의 위장관에서 채취한 조직 샘플에서 발견되었으며, 동물 모델은 장 신경계의 알파-시누클레인 응집체가 프리온과 같은 방식으로 중추 신경계(9)에 퍼진다는 것을 시사한다. 또한, 복막투석 환자는 장내 마이크로바이옴(microbiome)10에 이상을 보이며 과도한 장내 염증을 경험할 수 있다11. 파킨슨병의 변비는 파리(12,13) 또는 설치류(14,15)에서 파킨슨병과 관련된 변비에 대한 보고된 모델은 거의 없는 등 연구가 부족했다.
이 분석실험은 파리가 범 뉴런 드라이버인 n-synaptobrevin의 통제하에 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하는 PD의 초파리 모델을 사용합니다. 이 파리는 알파-시누클레인 응집, 운동 기능 장애 및 노화 관련 신경 퇴행을 포함한 PD의 모든 특징을 나타내어 도파민 뉴런16,17의 손실을 초래합니다. 이전 연구에서는 소화 시스템의 기능적 차이를 밝히기 위해 파리의 배설물 배출량을 측정하고, 파리의 배설물을 정량화하고, 다양한 유전 계통에 걸쳐 배설량을 비교하는 방법을 도입했습니다 18,19,20. 여기에서, 우리는 인간 알파 시누클레인을 발현하는 파리를 이용한 변비 분석을 시연한다. 이 간단하지만 유용한 도구를 사용하면 PD의 중요한 비운동 증상을 연구할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 분석을 성공적으로 완료하는 데 도움이 되는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 각 바이알에 대한 각 라운드 사이의 시간 간격이 실험 전반에 걸쳐 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 바이알에 번호를 표시하면 긴 유전자형 설명의 필요성을 피하고 시간을 절약하는 데 도움이 됩니다. 또한, 배설물(22 )을 계수하는 방법이 실험 전반에 걸쳐 일관되게 유지되는 것이 중요하다. 파란색 배설물은 음식과 바이알 플러그에서 볼 수 있지만 무색의 배설물은 보이지 않습니다. 따라서 음식이나 바이알 플러그의 파란색 점을 세지 마십시오.
행동 분석에서는 파리 행동의 변동 또는 분석에 영향을 미치는 알 수 없는 변수로 인해 결과가 일치하지 않을 가능성이 항상 있습니다. 모든 실험에 동일한 초파리 배지, 동일한 식용 염료 및 동일한 브랜드의 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 몇몇 실험에서 파리는 이른 오후에 배변을 덜 하는 경향이 있는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 파리의 일주기 리듬23 때문일 것이다. 그러나, 이 행동은 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리 둘 다에서 일관됩니다, 그래서 우려를 일으키면 안됩니다.
분석 초기에 파리가 푸른 배설물을 배설하지 않으면 사용된 염료가 충분히 착색되지 않았을 수 있습니다. 이 경우 그에 따라 염료와 증류수의 비율을 높일 수 있습니다. 또한 파리의 소화관에 소량의 파란색 음식만 남아 있을 때 배설물이 옅은 파란색인지 무색인지 판단하기 어려울 수도 있습니다. 이런 일이 발생하면 바이알 뒤에 흰색 종이를 놓으면 배설물 점의 색상을 결정하는 데 도움이 됩니다. 배설물이 매우 연한 파란색일지라도 무색의 배설물보다는 파란색 배설물로 기록하는 것이 가장 좋습니다.
이 분석의 한 가지 한계는 대변 반점을 수동으로 계산해야 한다는 것입니다. 고처리량 스크리닝의 가능성을 개선하기 위해 이 프로토콜은 향후 다중 웰 플레이트에서 개별 파리에 의해 생성된 청색 분변 반점을 자동으로 정량화할 수 있도록 수정될 수 있습니다. 또 다른 한계는, 알파 synuclein 모형이 PD의 전구 모형으로 발전되는 잠재력이 있더라도, 변비가 neurodegeneration 없이 출석하는 최선 시점이 아직 확인되지 않았다 입니다.
요약하면, 이 방법은 PD의 초파리 모델에서 연구가 부족한 비운동 PD 증상인 변비를 모델링하는 간단하고 직접적인 접근 방식을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 Brigham and Women’s Hospital과 Harvard Medical School의 Mel Feany 박사에게 대조군과 알파 시누클레인 발현 초 파리 계통의 친절한 선물을 주신 것을 인정합니다. NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson’s Disease Early Investigator Award와 같은 Olsen 박사에 대한 보조금 지원 출처를 인정합니다.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |