概要

Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей

Published: September 22, 2023
doi:

概要

Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.

Abstract

Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.

Introduction

Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая нить является ненервной структурой, которая прикрепляет спинной мозг к крестцу. Кроме того, нервные волокна выходят через межпозвонковое отверстие1.

Развитие и правильное функционирование центральной нервной системы у млекопитающих в решающей степени зависит от активности резидентных макрофагов нервной системы, называемых микроглией4. Хотя микроглия первоначально описывалась как резидентные фагоциты мозга, недавние исследования приписывают этим клеткам множество динамических функций 5,6. Размер микроглии колеблется от 7 до 10 мкм в гомеостазе; Они считаются одними из самых универсальных клеток в организме и могут морфологически и функционально адаптироваться к постоянно меняющейся окружающей среде7. Эти клетки демонстрируют высокую гетерогенность как на эмбриональной, так и на взрослой стадиях8,9, в то время как на взрослой стадии они также демонстрируют сложную функциональную гетерогенность, основанную на их пространственно-временном контексте10. Гетерогенность и множественность функций микроглии обеспечивают дифференцированную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. Показано, что экспрессия CD11b, CD45, CD86 и CCR9 выше в спинном мозгепо сравнению с головным мозгом 8,9.

Существует несколько протоколов для выделения церебральной микроглии11,12; Однако для микроглии спинного мозга13,14 существует лишь несколько. Оптимизация метода очистки микроглии от спинного мозга способствует развитию многочисленных исследований, направленных на изучение физиологии микроглии. Этот протокол направлен на описание простого и высоковоспроизводимого извлечения спинного мозга мыши и очистки микроглии (рис. 1).

Protocol

Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики…

Representative Results

С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали ?…

Discussion

Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очис?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.

Materials

15 mL collection tubes Corning, USA 430790
2 mL microtubes Axygen, USA MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR BioLegend, USA 101302
50 mL collection tubes Corning, USA 430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) Gibco, USA 15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse eBioscience, USA 48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse   BioLegend, USA 103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free Corning, USA 46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm Corning, USA 352340
Costar 6-well Clear Not Treated  Corning, USA CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath  Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA 88870001
Dissecting forceps for microsurgery FT by DUMONT
DNase Roche, USA 4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)  Merck, USA D6429
Electric shaver
FACS tube Thermo, USA 352058
Fetal bovine serum (FBS) PAN Biotech, Alemania P30-3306
Flow cytometer Cytoflex  Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution  Merck, USA H2387
L-glutamine Corning, USA  15393631
Liberase TM  Roche, USA 5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers China 1103
Pentobarbital
Percoll  Merck, USA 17089101 density gradient centrifugation 
Poly-L-lysine solution  Merck, USA P8920
Scalpel No. 25  HERGOM, Mexico H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL Axygen, USA 10011-680
Stereoscopic microscope Velab, Mexico HG927831
Straight surgical scissors (10 cm) HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors HERGOM, Mexico
Triton X100 Merck, USA X100
Trypan blue Stain 0.4%  Merck, USA 15250-061
Vortex mixer DLAB, China 8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend, USA 423102 amine-reactive fluorescent dye staining 

参考文献

  1. Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
  4. Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  5. Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
  6. Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  7. Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  8. de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  9. Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
  10. Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  11. Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
  12. Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
  13. Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
  14. Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
  15. Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
  16. Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
  17. Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  18. Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
  19. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).

Play Video

記事を引用
Gutiérrez-Román, C. I., Meléndez Camargo, M. E., García Rojas, C. C., Jimenez Olvera, M., Gutiérrez Román, S. H., Medina-Contreras, O. Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65961, doi:10.3791/65961 (2023).

View Video