Detectie en kwantificering van mono-rhamnolipiden en di-rhamnolipiden geproduceerd door Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa is een omgevingsbacterie en een opportunistische ziekteverwekker die zeer zorgwekkend is vanwege de productie van virulentie-geassocieerde eigenschappen en de hoge antibioticaresistentie ^1,2. Een kenmerkende secundaire metaboliet die door deze bacterie wordt geproduceerd, is de biosurfactant RL, die op een gecoördineerde manier wordt geproduceerd met verschillende virulentie-geassocieerde eigenschappen zoals het fenazine pyocyanine, een antibioticum met redoxactiviteit, en het protease elastase³. De tensioactieve en emulgerende eigenschappen van RL zijn geëxploiteerd in verschillende industriële toepassingen en worden momenteel gecommercialiseerd⁴.

De meeste P. aeruginosa-stammen, die behoren tot fylogroepen 1 en 2, produceren twee soorten RL: mRL, dat bestaat uit één rhamnosegroep die is gekoppeld aan een vetzuurdimeer dat voornamelijk uit 10 koolstofatomen bestaat, en dRL, dat een extra rhamnosegroep bevat die is gekoppeld aan de eerste rhamnose⁴ (zie figuur 1). Er is echter gemeld dat twee kleine P. aeruginosa fylogroepen (groepen 3 en 5) slechts mRL ^5,6 produceren. De twee soorten RL bevatten een mengsel van vetzuurdimeren, die, zoals gezegd, voornamelijk C10-C10 zijn, maar er worden ook kleinere hoeveelheden moleculen geproduceerd die C12-C10, C12-C12 en C10-C12:1-dimeren bevatten. De karakterisering van de RL-congeneren geproduceerd door verschillende stammen met behulp van HPLC MS/MS is gerapporteerd ^7,8. De methoden die in dit werk worden beschreven, kunnen alleen onderscheid maken tussen mRL en dRL, maar kunnen niet worden gebruikt voor de karakterisering van de RL-congeneren.

P. aeruginosa en sommige Burkholderia-soorten zijn natuurlijke producenten van RL⁹, maar de eerste bacterie is de meest efficiënte producent. Commercieel gebruikte RL wordt momenteel echter geproduceerd in Pseudomonas putida KT2440-derivaten die P. aeruginosa-genen tot expressie brengen om het gebruik van deze opportunistische ziekteverwekker te vermijden^10,11. De detectie en kwantificering van RL geproduceerd door P. aeruginosa zijn van groot belang voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de expressie van virulentiegerelateerde eigenschappen¹², voor de karakterisering van stammen die behoren tot clades 3 of 5¹³, en voor het construeren van P. aeruginosa-derivaten die deze biosurfactanten overproduceren terwijl ze de virulentie verminderen¹⁴. De productie van biosurfactanten door verschillende micro-organismen is gedetecteerd op basis van enkele algemene kenmerken van deze verbindingen, zoals de collapsdruppelmethode of emulgeringsindex¹⁵, maar deze methoden zijn noch nauwkeurig, noch specifiek¹⁶.

Hier beschrijven we het protocol om mRL en dRL te detecteren met behulp van de vloeistofextractie van totaal RL uit de kweeksupernatanten van verschillende P. aeruginosa-type stammen en de scheiding van beide typen RL met behulp van TLC. Bij deze methode wordt de RL die uit het cultuursupernatans wordt geëxtraheerd, gescheiden door hun differentiële oplosbaarheid in de oplosmiddelen die voor TLC worden gebruikt, waardoor differentiële migratie op de silicagelplaat ontstaat. mRL heeft dus een snellere migratie dan dRL en ze kunnen worden gedetecteerd als afzonderlijke vlekken wanneer de platen worden gedroogd en gekleurd met α-naftol.

De hier beschreven methode voor het detecteren van mRL en dRL door TLC is gebaseerd op een eerder gepubliceerd artikel¹⁷, dat eenvoudig uit te voeren is en geen dure apparatuur vereist. Deze methode is nuttig geweest voor het detecteren van RL in verschillende P. aeruginosa-isolaten ¹³ met behulp van geschikte controles, zoals een van P. aeruginosa afgeleide mutant die geen RL kan produceren. Het is echter niet de voorkeursmethode voor het karakteriseren van nieuwe biosurfactanten geproduceerd door andere bacteriën dan Pseudomonas aeruginosa vanwege het gebrek aan specificiteit.

Daarnaast wordt een methode gepresenteerd voor het kwantificeren van de rhamnose-equivalenten van de totale RL geëxtraheerd uit een P. aeruginosa-cultuursupernatans . Deze methode kwantificeert deze biosurfactanten op basis van de reactie van orcinol met reductieve suikers, wat resulteert in een product dat spectrofotometrisch kan worden gemeten bij 421 nm, zoals eerder beschreven¹⁸. Aangezien de reactie met orcinol niet specifiek is voor rhamnose, is het belangrijk om deze methode uit te voeren met RL geëxtraheerd uit het cultuursupernatans dat geen significante hoeveelheden andere suikerhoudende moleculen, zoals lipopolysacchariden (LPS), bevat. Een aangezuurd chloroform/methanolmengsel wordt hier gebruikt voor vloeibare extractie van RL¹⁸, maar ethylacetaat kan ook worden gebruikt, en vastefase-extractie (SPE) levert zeer goede resultaten op¹⁹. De hier beschreven orcinol-methode vereist geen geavanceerde apparatuur en kan betrouwbare resultaten opleveren als deze met speciale zorg wordt uitgevoerd bij het voorbereiden van de geanalyseerde monsters, zoals besproken. Om een goede monstervoorbereiding te garanderen, is het belangrijk om een Pseudomonas aeruginosa rhlA-mutant die geen RL²⁰ kan produceren, op te nemen en om voor elke bepaling drie biologische en drie technische replicaten uit te voeren.

Er is aanzienlijke controverse geweest in de literatuur ^16,21 met betrekking tot RL-bepaling door de orcinol-methode, waarbij sommige studies suggereren dat de RL-productie wordt overschat en dat de test niet specifiek is voor rhamnose, waardoor mogelijk andere suikers worden gedetecteerd. We tonen hier echter aan dat de beschreven methoden onder de juiste omstandigheden nauwkeurig en specifiek kunnen zijn. Bovendien maken we voor vergelijking met de procedures die in dit artikel worden beschreven, gebruik van UPLC-MS/MS-detectie van een dRL-standaard en tonen we aan dat vergelijkbare resultaten worden verkregen met de orcinol-methode. Het gedetailleerde protocol voor het kwantificeren van RL met behulp van deze methode is opgenomen in aanvullend bestand 1.

Deze protocollen worden geïllustreerd met behulp van de typestammen PAO1 (fylogroep 1), PA14 (fylogroep 2) en PA7 (fylogroep 3). Deze stammen zijn gekozen omdat ze goed gekarakteriseerd zijn en verschillende RL-profielen produceren.