녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 생산된 Mono-Rhamnolipids 및 Di-Rhamnolipids의 검출 및 정량화
概要
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 람놀리피드 생물 계면활성제를 생산합니다. 박층 크로마토그래피는 각 균주에 의해 생성된 mono- rhamnolipid와 di-rhamnolipid의 비율을 검출하고 측정합니다. 총 람놀리피드의 정량화에는 오르시놀 방법을 사용하여 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제에 존재하는 람노스 등가물을 평가하는 것이 포함됩니다.
Abstract
환경 박테리아 녹농균(Pseudomonas aeruginosa )은 항생제 내성이 높아 건강에 위험을 초래하는 기회 감염 병원체입니다. 이 박테리아는 람놀라이피드(RL)로 알려진 생물 계면활성제를 고농도로 생성하는데, 이 계면활성제는 생명공학적 가치가 있는 분자이지만 독성 특성과도 관련이 있습니다. 이러한 점에서, RL의 검출 및 정량화는 생명공학 응용 분야와 생물 의학 연구 프로젝트 모두에 유용할 수 있습니다. 이 기사에서는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 녹농균에 의해 생성되는 두 가지 형태의 RL의 생성을 검출하는 기술을 단계별로 보여줍니다: 단일 람인지질(mRL), 하나의 람노스 부분에 연결된 지방산 이량체(주로 C10-C10)로 구성된 분자 및 두 개의 람노스 부분에 연결된 유사한 지방산 이량체로 구성된 분자인 디-람놀리피드(dRL). 또한, 녹농 균 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제의 산 가수분해와 오르시놀과 반응하는 람노스 농도의 후속 검출을 기반으로 RL의 총량을 측정하는 방법을 제시합니다. 두 기법의 조합은 유형 균주 PAO1(계통군 1), PA14(계통군 2) 및 PA7(계통군 3)과 함께 여기에 예시된 바와 같이 특정 균주에 의해 생성된 mRL 및 dRL의 대략적인 농도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 환경 박테리아이며 독성 관련 형질의 생성과 높은 항생제 내성으로 인해 큰 우려가 있는 기회 감염 병원체입니다 1,2. 이 박테리아에 의해 생성되는 특징적인 2차 대사 산물은 생물 계면활성제 RL이며, 이는 산화 환원 활성을 가진 항생제인 페나진 피오시아닌(phenazine pyocyanin) 및 프로테아제 엘라스타제3와 같은 여러 독성 관련 특성과 조화롭게 생산됩니다. RL의 텐시오 활성 및 유화 특성은 다양한 산업 응용 분야에서 활용되었으며 현재 상용화되어 있습니다4.
계통군 1 및 2에 속하는 대부분의 녹농균 균주는 두 가지 유형의 RL을 생성한다: 주로 10개의 탄소로 구성된 지방산 이량체에 연결된 하나의 람노스 부분으로 구성된 mRL과 첫 번째 람노스4에 연결된 추가적인 람노스 부분을 포함하는 dRL. 그러나 두 개의 작은 녹농균 계통군(그룹 3 및 5)은 mRL 5,6만 생성하는 것으로 보고되었습니다. RL의 두 가지 유형은 언급한 바와 같이 주로 C10-C10인 지방산 이량체의 혼합물을 포함하지만 C12-C10, C12-C12 및 C10-C12:1 이량체를 포함하는 분자의 더 작은 비율도 생성됩니다. HPLC MS/MS를 사용하여 다양한 균주에 의해 생성된 RL 동족체의 특성화가 보고되었습니다 7,8. 이 연구에서 기술된 방법은 mRL과 dRL만 구별할 수 있을 뿐 RL 동족체의 특성 분석에는 사용할 수 없습니다.
녹농균(P. aeruginosa)과 일부 버크홀데리아(Burkholderia) 종은 RL9의 자연 생산자이지만, 이전의 박테리아가 가장 효율적인 생산자입니다. 그러나, 상업적으로 사용되는 RL은 현재 이러한 기회주의적 병원체의 사용을 피하기 위해 녹농균 유전자를 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440 유도체에서 생산되고 있다(10,11). 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 생성된 RL의 검출 및 정량화는 독성 관련 형질(12)의 발현에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하고, 군(clade) 3 또는 5에 속하는 균주의 특성 분석(13)하며, 독성을 감소시키면서 이러한 생물계면활성제를 과도하게 생산하는 녹농균 유도체(P. aeruginosa derivatives)를 구성하는 데 매우 중요하다14. 다양한 미생물에 의한 생물 계면 활성제의 생산은 붕괴 방울 방법 또는 유화 지수15와 같은 이러한 화합물의 일부 일반적인 특성에 기초하여 검출되었지만, 이러한 방법은 정확하지도 않고 특이적이지도 않다16.
여기에서는 다양한 녹농균 유형 균주의 배양 상층액에서 총 RL을 액체 추출하고 TLC를 사용하여 두 유형의 RL을 분리하여 mRL 및 dRL을 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서는 배양 상층액에서 추출한 RL을 TLC에 사용되는 용매의 용해도에 따른 차등 용해도에 의해 분리하여 실리카겔 플레이트에서 차등 이동을 일으킵니다. 따라서 mRL은 dRL보다 더 빠른 이동을 가지며 플레이트를 건조하고 α-나프톨로 염색할 때 별도의 반점으로 검출될 수 있습니다.
TLC에 의한 mRL 및 dRL을 검출하기 위해 여기에 설명된 방법은 이전에 발표된 논문17을 기반으로 하며, 이는 수행하기 쉽고 고가의 장비를 필요로 하지 않는다. 이 방법은 RL을 생산할 수 없는 P. aeruginosa-유래 돌연변이와 같은 적절한 대조군을 사용하여 다양한 P. aeruginosa 분리체(13)에서 RL을 검출하는 데 유용하다. 그러나, 이는 특이성이 부족하기 때문에 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 이외의 박테리아에 의해 생성되는 새로운 생물 계면활성제를 특성화하는 데 선호되는 방법은 아닙니다.
또한, 녹농균 배양 상층액에서 추출한 총 RL의 람노스 등가물을 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 오르시놀과 환원당의 반응에 기초하여 이러한 생물계면활성제를 정량화하며, 그 결과 앞서 설명한 바와 같이 421nm에서 분광광도계로 측정할 수 있는 생성물이 생성된다18. 오르시놀과의 반응은 람노스에 특이적이지 않기 때문에, 리포다당류(LPS)와 같은 다른 당 함유 분자를 상당량 함유하지 않는 배양 상청액에서 추출한 RL로 이 방법을 수행하는 것이 중요합니다. 산성화된 클로로포름/메탄올 혼합물은 RL18의 액체 추출을 위해 여기에 사용되지만, 에틸 아세테이트도 사용할 수 있으며, 고체상 추출(SPE)은 매우 우수한 결과를 산출한다19. 여기에 설명된 오르시놀 방법은 정교한 장비를 필요로 하지 않으며, 논의된 바와 같이 분석된 샘플을 준비할 때 특별한 주의를 기울여 수행할 경우 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있습니다. 적절한 시료 전처리를 위해서는 RL20을 생성할 수 없는 녹농균 rhlA 돌연변이를 포함하고 각 측정에 대해 3번의 생물학적 복제와 3번의 기술적 복제를 수행하는 것이 중요합니다.
문헌16,21에서 오르시놀 방법에 의한 RL 측정과 관련하여 상당한 논란이 있었으며, 일부 연구에서는 RL 생산이 과대평가되고 분석법이 람노스에 대한 특이성이 부족하여 잠재적으로 다른 당을 검출할 수 있다고 제안했습니다. 그러나 여기에서 설명된 방법이 적절한 조건에서 정확하고 구체적일 수 있음을 보여줍니다. 또한 이 기사에 설명된 절차와 비교하기 위해 dRL 표준물질의 UPLC-MS/MS 검출을 활용하고 orcinol 분석법으로도 유사한 결과를 얻을 수 있음을 입증합니다. 이 방법을 사용하여 RL을 정량화하기 위한 자세한 프로토콜은 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.
이들 프로토콜은 유형 균주 PAO1(계통군 1), PA14(계통군 2) 및 PA7(계통군 3)을 사용하여 예시된다. 이러한 균주는 특성이 잘 규명되고 다양한 RL 프로필을 생성하기 때문에 선택되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RL을 검출하고 정량화하는 가장 정확한 방법은 질량 분석법(MS)7,8,27과 결합된 HPLC입니다. 그러나 많은 연구자가 접근하기 어려울 수 있는 전문적이고 값비싼 장비가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 RL 농도를 검출하고 추정하기 위해 기본 실험실 재료 및 장비를 사용하여 일상적으로 수행할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항, 특?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GSCh 실험실은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM의 보조금 IN201222으로 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| 1-NAPHTHOL | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| ACETIC ACID | J.T. BAKER | 9508-02 | |
| CENTRIFUGE | For centrifuging tubes 1.5 mL and 50 mL | ||
| CHLOROFORM | J.T. BAKER | 9180-02 | |
| DRYING OVEN | |||
| ETHER | J.T. BAKER | 9244-02 | |
| GLASS PIPETTE | SIGMA-ALDRICH | CLS706510 | |
| HYDROCHLORIC ACID | J.T. BAKER | 5622-02 | |
| LB | |||
| L-RHAMNOSE MONOHYDRATE | SIGMA-ALDRICH | R-3875 | |
| METHANOL | J.T. BAKER | 9049-02 | |
| ORCINOL MONOHYDRATE | SIGMA-ALDRICH | O1875 | |
| PPGAS Broth | Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M), Peptone (1%), pH 7.4 Autoclaved. Add Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M) | ||
| QUARTZ CELL (CUVETTE) | SIGMA-ALDRICH | Z276669 | |
| RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK | FISHER SCIENTIFIC | K4161801020 | |
| RHAMNOLIPIDS | SIGMA-ALDRICH | R-90 | |
| SPECTROPHOTOMETER | VIS | ||
| SPRAYER | SIGMA-ALDRICH | Z529710-1EA | |
| SULFURIC ACID | J.T. BAKER | 9681-02 | |
| TES TUBES 5mL | CORNING | 352002 | |
| TLC SILICA GEL 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| WATER BATH | > 80 °C |
参考文献
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