Предварительное расследование подтверждает, что субарахноидальное кровоизлияние (САК) вызывает гибель перицитов головного мозга. Оценка сократительной способности перицитов после САК требует дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга. В связи с этим была разработана процедура одновременной маркировки жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, что облегчает наблюдение с помощью конфокального микроскопа высокого разрешения.
Перициты являются важнейшими клетками-стенками, расположенными в микроциркуляции головного мозга, которые играют ключевую роль в активной модуляции мозгового кровотока путем регулирования сократительной способности. Обычно их сократительная способность измеряется путем наблюдения морфологических сдвигов и изменений диаметра капилляров в непосредственной близости при определенных обстоятельствах. Тем не менее, посттканевая фиксация, оценка жизнеспособности и последующая сократительная способность перицитов визуализированных перицитов головного мозга оказывается под угрозой. Аналогичным образом, генетическая маркировка перицитов головного мозга не позволяет провести различие между жизнеспособными и нежизнеспособными перицитами, особенно при неврологических состояниях, таких как субарахноидальное кровоизлияние (САК), когда наше предварительное исследование подтверждает гибель перицитов головного мозга. Для преодоления этих ограничений был разработан надежный протокол, позволяющий одновременно флуоресцентно помечать как функциональные, так и нефункциональные перициты мозга в отделах мозга. Этот метод мечения позволяет визуализировать с помощью конфокального микроскопа с высоким разрешением, одновременно отмечая микроциркуляторное русло среза мозга. Этот инновационный протокол позволяет оценить сократительную способность перицитов головного мозга, их влияние на диаметр капилляров и структуру перицитов. Исследование сократительной способности перицитов головного мозга в контексте САК дает глубокое понимание ее влияния на церебральную микроциркуляцию.
Перициты головного мозга, отличающиеся тонкими выпуклостями и выступающими телами клеток, окружают микроциркуляцию 1,2. В то время как увеличение мозгового кровотока в основном обусловлено расширением капилляров, более мелкие артерии демонстрируют более медленные темпы расширения3. Сократительная способность перицитов оказывает влияние на диаметр капилляров и морфологию перицитов, влияя на сосудистую динамику4. Сокращение перицитов головного мозга приводит к сужению капилляров, а при патологических сценариях чрезмерное сокращение может препятствовать потоку эритроцитов5. Различные факторы, в том числе норадреналин, высвобождаемый из locus coeruleus, могут индуцировать сокращение перицитов головного мозга в капиллярах6. Выполняя регуляторную роль в мозговом кровотоке, перициты проявляют синтез 20-HETE, выступая в качестве датчика кислорода во время гипероксии7. Вызванное окислительно-нитративным стрессом сокращение перицитов головного мозга пагубно влияет на капилляры5. Несмотря на исследования сокращения перицитов головного мозга как で vivo, так и ex vivo, сохраняются ограниченные знания относительно визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитовмозга в срезах мозга.
Важно отметить, что посттканевая фиксация перицитов головного мозга ставит под угрозу их жизнеспособность и последующую оценку сократительной способности. Более того, в таких сценариях, как неврологические расстройства (например, субарахноидальное кровоизлияние – САК), трансгенное мечение перицитов головного мозга не позволяет дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные перициты, что подтверждается нашим предварительным исследованием САК-индуцированной смерти перицитов головного мозга9.
Чтобы преодолеть эти трудности, мы использовали TO-PRO-3 для маркировки живых перицитов, в то время как умершие были окрашены йодидом пропидия (PI). Мы использовали технологии конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов мозга в срезах мозга, сохраняя активность срезов во время визуализации. Целью данной статьи является представление воспроизводимого метода визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, служащего ценным инструментом для исследования влияния перицитов головного мозга на церебральную микроциркуляцию после САК.
Разработаны методы конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизненно важных перицитов головного мозга, невитальных перицитов головного мозга и микроциркуляторного русла в срезах мозга. В острых срезах мозга крыс процесс включает в себя первоначальное мечение …
The authors have nothing to disclose.
Исследование поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81960226,81760223); Фонд естественных наук провинции Юньнань (202001AS070045,202301AY070001-011)
6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | Image J | RT |
Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |