여기서는 세포 사멸 유도 후 접종된 잎을 지속적으로 이미징하여 프로그래밍된 세포 사멸 개시 속도를 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
과민반응(HR) 부여 저항은 N 저항 유전자에 의해 결정될 수 있는 효과적인 방어 반응입니다. HR은 접종된 잎에 세포 사멸 구역이 형성되는 것으로 나타납니다. 여기에서, 디지털 현미경을 이용하여 세포 사멸 개시와 세포 사멸 출현 사이의 시간 동안 접종된 잎을 이미징하여 세포 사멸 개시 속도를 연구하기 위한 프로토콜이 제시된다. 디지털 현미경은 원하는 간격으로 연속 이미징 프로세스를 가능하게 하여 기존 방법의 몇 시간과 달리 세포 사멸 개시 속도를 최대 몇 분 만에 정확하게 측정할 수 있습니다. 디지털 현미경을 사용한 이미징은 빛과 무관하므로 식물의 생체 리듬을 방해하지 않고 낮과 밤에 사용할 수 있습니다. 프로그램된 세포 사멸 발달을 초래하는 다른 병리체계는 약간의 수정을 가진 이 프로토콜을 사용하여 공부할 수 있었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 세포 사멸 개시율의 간단하고 정확하며 저렴한 식별을 가능하게 합니다.
감자는 세계에서 가장 널리 재배되는 식량 작물 중 하나이며 쌀, 밀, 옥수수에 이어 4위를 차지합니다. 그러나 감자 생산은 현재 가장 중요한 바이러스 병원체로 간주되는 감자 바이러스 Y(PVY)에 의해 심각한 영향을 받을 수 있습니다 1,2. 감자 식물 cv. Rywal, PVY의 여러 균주(PVY 균주 N-Wilga 포함)는 감염 부위에 대한 병원체의 제한이 접종된 잎에 괴사성 병변으로 나타나는 과민반응(HR) 부여 내성을 유발합니다3. 이 병리계에서 HR은 온도에 의존하는 Ny-1 저항성 유전자에 의해 매개되는데, 이는 낮은 온도에서 자란 식물이 괴사성 병변을 효율적으로 발달시키는 반면, 고온(28°C)에서 체질적으로 자란 식물에서는 병변 형성 부족과 전신 바이러스 확산으로 저항성 포기가 입증된다 3,4. 식물이 더 낮은 온도(22°C)로 옮겨지면 세포 사멸이 시작되며, 이는 세포 사멸 시작과 세포 사멸 외관 사이의 시간에 접종된 잎을 이미징하여 세포 사멸 개시 속도를 추적하기 위해 이용될 수 있습니다.
이 프로토콜은 디지털 현미경을 사용하여 세포 사멸 개시율을 결정하는 간단한 방법을 보여줍니다. 식물을 28°C에서 22°C로 옮긴 후 접종된 잎을 이미징함으로써 디지털 현미경을 통해 원하는 간격으로 잎을 연속적으로 관찰할 수 있습니다. 다른 방법(예: 공초점 현미경 또는 육안으로 병변 형성 관찰)의 사용과 달리, 이를 통해 병변 형성의 정확한 시간을 결정할 수 있으므로 앞서 언급한 방법 5,6의 시간과 달리 세포 사멸 개시율을 최대 분까지 정확하게 측정할 수 있습니다. 디지털 현미경 사용은 빛과 무관하므로 낮과 밤에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 세포 사멸 개시에 관련된 성분을 식별하거나 사용된 식물이 형질전환되고 관심 성분의 변경된 수준을 갖는 경우 세포 사멸 개시 속도에 대한 다른 성분의 효과를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
시연된 프로토콜을 통해 사용자는 디지털 현미경을 사용하여 세포 사멸 시작과 세포 사멸 외관 사이의 시간 동안 접종된 잎을 지속적으로 이미징하여 세포 사멸 개시율을 정확하게 결정할 수 있습니다. 병변 및 식물 질병 발생을 모니터링하는 방법에는 여러 가지가 있지만(12,13,14,15), 이 프로토콜은 측정 사이에 빛이 꺼지기 때문에 식물의 일주기 리듬을 방해하지 않고 빛과 무관한 측정의 이점을 제공합니다.
접종 후 식물은 28°C에서 3일 동안 자라야 합니다. 과민반응을 유발하는 Ny-1 저항성 유전자는 온도에 따라 달라지며, 고온에서 자란 식물에서는 저항성 결핍을 유발하여 병변 형성 부족과 전신 바이러스 확산으로 나타난다3. 식물을 22°C로 옮긴 후 세포 사멸이 시작되므로 정확한 결과를 얻으려면 이 이동 후 가능한 한 빨리 디지털 현미경으로 관찰을 시작해야 합니다. 이미징을 위한 식물 준비의 또 다른 중요한 단계는 잎을 고정하는 것인데(그림 1D), 이미징 중에 식물이 계속 자라 관찰된 잎이 초점에서 벗어나거나 이러한 설정이 원하는 결과를 얻지 못할 수 있기 때문입니다.
설명된 프로토콜이 세포 사멸 개시에 관여하는 것으로 가정되는, 관심의 변경된 성분을 갖는 형질전환 식물에 사용되는 경우, 프로토콜은 사용자가 연구된 성분의 감소된 수준이 세포 사멸 개시 속도에 영향을 미치는지 여부를 결정할 수 있게 한다. 이를 통해 세포 사멸 개시에 관여하는 구성 요소는 이 프로토콜을 사용하여 프로그래밍된 세포 사멸이 발생하는 병리계에서 확인할 수 있습니다. 이러한 성분을 식별하기 위한 다른 방법은, 예를 들어, RNA-seq 또는 다양한 형태의 현미경과 같은 전사체 분석이며, 이는 비용과 시간이 많이 소요될 수 있다16. 이 프로토콜에 기술된 방법은 형질전환 식물과 대조군 식물 사이의 세포 사멸 개시율의 차이를 관찰함으로써 세포 사멸 개시에 관여하는 성분의 쉽고 저렴한 식별을 가능하게 한다. 최적으로, 이러한 설정에서는 형질전환 식물이 동일한 실험 내에서 대조 식물과 병렬로 분석되어야 하기 때문에 두 대의 디지털 카메라를 사용해야 합니다.
이 프로토콜에서는 PVY 균주 N-Wilga가 사용되었습니다. 그러나 이 바이러스의 다른 변종, 예를 들어 GFP 표지 PVY(PVY-N605(123)-GFP)7도 사용할 수 있습니다. 더욱이, 프로그램된 세포 사멸 발달을 초래하는 다른 병리계는 약간의 수정과 함께 이 프로토콜을 사용하여 연구될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
기술 지원을 제공해 주신 Barbara Jaklič에게 감사드립니다. 이 연구는 슬로베니아 연구 혁신 기관(연구 핵심 자금 지원 번호 P4-0165 및 프로젝트 Z4-3217: 바이러스에 대한 감자 내성의 산화 환원 관련 신호 상호 연결성 해독)의 재정 지원을 받았습니다.
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |