En este trabajo se presenta un protocolo para estudiar la tasa de inicio de la muerte celular programada mediante la obtención de imágenes continuas de las hojas inoculadas después de la inducción de la muerte celular.
La resistencia conferida por la respuesta hipersensible (HR) es una respuesta de defensa eficaz que puede ser determinada por los genes de resistencia N . La HR se manifiesta como la formación de zonas de muerte celular en las hojas inoculadas. Aquí, se presenta un protocolo para estudiar la tasa de inicio de la muerte celular mediante la obtención de imágenes de hojas inoculadas en el tiempo entre el inicio de la muerte celular y la aparición de la muerte celular utilizando un microscopio digital. El microscopio digital permite un proceso continuo de obtención de imágenes en los intervalos deseados, lo que permite una determinación precisa de la tasa de inicio de la muerte celular de hasta minutos exactos, a diferencia de las horas de los métodos tradicionales. Las imágenes con el microscopio digital también son independientes de la luz y, por lo tanto, se pueden utilizar durante el día y la noche sin perturbar el ritmo circadiano de la planta. Con este protocolo se podrían estudiar diferentes sistemas patológicos que dan lugar al desarrollo de la muerte celular programada con pequeñas modificaciones. En general, el protocolo permite una identificación simple, precisa y económica de la tasa de inicio de la muerte celular.
La papa es uno de los cultivos alimentarios más cultivados en el mundo, ocupando el cuarto lugar detrás del arroz, el trigo y el maíz. Sin embargo, la producción de papa puede verse gravemente afectada por el virus Y de la papa (PVY), que actualmente se considera su patógeno viral más importante 1,2. En plantas de papa cv. Rywal, varias cepas de PVY (incluida la cepa de PVY N-Wilga) desencadenan una resistencia conferida por la respuesta de hipersensibilidad (HR), donde la restricción del patógeno al sitio de infección se manifiesta como lesiones necróticas en las hojas inoculadas3. En este patosistema, la HR está mediada por el gen de resistencia Ny-1, que depende de la temperatura, ya que las plantas cultivadas a temperaturas más bajas desarrollan eficientemente lesiones necróticas, mientras que en las plantas cultivadas constitutivamente a temperatura elevada (28 °C), el aborto de la resistencia se demuestra como falta de formación de lesiones y diseminación sistémica del virus 3,4. Cuando las plantas se transfieren a una temperatura más baja (22 °C), se inicia la muerte celular, que puede aprovecharse para seguir la tasa de inicio de la muerte celular mediante la obtención de imágenes de hojas inoculadas en el tiempo entre el inicio de la muerte celular y la aparición de la muerte celular.
Este protocolo demuestra un método simple para la determinación de la tasa de inicio de la muerte celular utilizando un microscopio digital. Al obtener imágenes de las hojas inoculadas después de transferir la planta de 28 °C a 22 °C, un microscopio digital permite la observación continua de la hoja en los intervalos deseados. A diferencia del uso de otros métodos (por ejemplo, microscopía confocal u observación de la formación de la lesión a simple vista), este permite determinar el momento exacto de formación de la lesión y, por lo tanto, la tasa de inicio de la muerte celular hasta minutos exactos, a diferencia de las horas de los métodos mencionados 5,6. El uso del microscopio digital también es independiente de la luz y, por lo tanto, se puede utilizar durante el día y la noche. Este protocolo también se puede utilizar para identificar los componentes involucrados en el inicio de la muerte celular o para determinar los efectos de diferentes componentes en la tasa de inicio de la muerte celular si las plantas utilizadas son transgénicas y tienen niveles alterados de componentes de interés.
El protocolo demostrado permite al usuario determinar con precisión la tasa de inicio de la muerte celular mediante la obtención de imágenes continuas de las hojas inoculadas en el tiempo entre el inicio de la muerte celular y la aparición de la muerte celular utilizando un microscopio digital. A pesar de que existen numerosas formas de monitorear la aparición de lesiones y enfermedades de las plantas12,13,14,15, este protocolo presenta la ventaja de la medición independiente de la luz sin alterar el ritmo circadiano de la planta, ya que la luz se apaga entre mediciones.
Después de la inoculación, las plantas deben crecer a 28 °C durante 3 días. El gen de resistencia Ny-1 , que induce una respuesta de hipersensibilidad, depende de la temperatura y, en plantas cultivadas a temperaturas más altas, conduce al aborto de la resistencia, que se manifiesta como falta de formación de lesiones y propagación sistémica del virus3. Después de que las plantas se transfieren a 22 °C, se inicia la muerte celular, por lo que para obtener resultados precisos, la observación con un microscopio digital debe comenzar lo antes posible después de esta transferencia. Otro paso crucial en la preparación de la planta para la obtención de imágenes es la inmovilización de la hoja (Figura 1D), ya que la planta continuará creciendo durante la obtención de imágenes, lo que podría desenfocar la hoja observada, o dicha configuración no dará los resultados deseados.
Si el protocolo descrito se utiliza en plantas transgénicas con componentes alterados de interés, hipotetizados que están involucrados en la iniciación de la muerte celular, el protocolo permite al usuario determinar si la disminución del nivel de un componente estudiado afecta la tasa de iniciación de la muerte celular. De este modo, los componentes implicados en el inicio de la muerte celular pueden identificarse en los patosistemas, donde se produce la muerte celular programada, utilizando este protocolo. Otros métodos para identificar estos componentes son, por ejemplo, el análisis transcriptómico como el RNA-seq o diversas formas de microscopía, que pueden ser costosos y requerir mucho tiempo16. El método descrito en este protocolo permite identificar de manera fácil y económica los componentes involucrados en la iniciación de la muerte celular mediante la observación de diferencias en las tasas de iniciación de la muerte celular entre las plantas transgénicas y las de control. De manera óptima, en una configuración de este tipo, se deben utilizar dos cámaras digitales, ya que una planta transgénica debe analizarse en paralelo con una planta de control dentro del mismo experimento.
En este protocolo se utilizó la cepa PVY N-Wilga; sin embargo, también podrían utilizarse otras cepas de este virus, por ejemplo, PVY marcado con GFP (PVY-N605(123)-GFP)7. Además, otros patosistemas, que dan lugar al desarrollo de la muerte celular programada, podrían estudiarse utilizando este protocolo con pequeñas modificaciones.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Barbara Jaklič por su asistencia técnica. Esta investigación contó con el apoyo financiero de la Agencia Eslovena de Investigación e Innovación (financiación básica de la investigación n.º P4-0165 y proyecto Z4-3217: Desciframiento de la interconexión de señalización relacionada con redox en la resistencia de la patata contra los virus).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |