Nous présentons ici un protocole d’étude du taux d’initiation de la mort cellulaire programmée par imagerie en continu des feuilles inoculées après l’induction de la mort cellulaire.
La résistance conférée par la réponse hypersensible (HR) est une réponse de défense efficace qui peut être déterminée par les gènes de résistance à l’azote . La HR se manifeste par la formation de zones de mort cellulaire sur les feuilles inoculées. Ici, un protocole d’étude du taux d’initiation de la mort cellulaire par imagerie des feuilles inoculées dans le temps entre l’initiation de la mort cellulaire et l’apparition de la mort cellulaire à l’aide d’un microscope numérique est présenté. Le microscope numérique permet un processus d’imagerie continu aux intervalles souhaités, ce qui permet une détermination précise du taux d’initiation de la mort cellulaire jusqu’à quelques minutes exactement, par opposition à des heures dans les méthodes traditionnelles. L’imagerie au microscope numérique est également indépendante de la lumière et peut donc être utilisée de jour comme de nuit sans perturber le rythme circadien de la plante. Différents pathosystèmes entraînant le développement de la mort cellulaire programmée pourraient être étudiés à l’aide de ce protocole avec des modifications mineures. Dans l’ensemble, le protocole permet ainsi une identification simple, précise et peu coûteuse du taux d’initiation de la mort cellulaire.
La pomme de terre est l’une des cultures vivrières les plus cultivées au monde, à la quatrième place derrière le riz, le blé et le maïs. Cependant, la production de pommes de terre peut être gravement affectée par le virus Y de la pomme de terre (PVY), qui est actuellement considéré comme son agent pathogène viral le plus important 1,2. Dans les plants de pommes de terre cv. Rywal, plusieurs souches de virus Y (y compris la souche N-Wilga du virus Y) déclenchent une résistance conférée par la réponse hypersensible (HR), où la restriction de l’agent pathogène au site d’infection se manifeste par des lésions nécrotiques sur les feuilles inoculées3. Dans ce pathosystème, la HR est médiée par le gène de résistance Ny-1, qui dépend de la température, car les plantes cultivées à des températures plus basses développent efficacement des lésions nécrotiques, tandis que chez les plantes cultivées de manière constitutive à une température élevée (28 °C), l’avortement de la résistance est démontré par l’absence de formation de lésions et la propagation systémique du virus 3,4. Lorsque les plantes sont transférées à une température plus basse (22 °C), la mort cellulaire est initiée, qui peut être exploitée pour suivre le taux d’initiation de la mort cellulaire en imageant les feuilles inoculées dans le temps entre l’initiation de la mort cellulaire et l’apparition de la mort cellulaire.
Ce protocole démontre une méthode simple pour déterminer le taux d’initiation de la mort cellulaire à l’aide d’un microscope numérique. En imageant les feuilles inoculées après le transfert de la plante de 28 °C à 22 °C, un microscope numérique permet d’observer en continu la feuille aux intervalles souhaités. Contrairement à l’utilisation d’autres méthodes (par exemple, la microscopie confocale ou l’observation de la formation des lésions à l’œil nu), cela permet de déterminer le moment exact de la formation des lésions et, par conséquent, le taux d’initiation de la mort cellulaire jusqu’à quelques minutes exactement, par opposition aux heures dans les méthodes susmentionnées 5,6. L’utilisation du microscope numérique est également indépendante de la lumière et peut donc être utilisée de jour comme de nuit. Ce protocole peut également être utilisé pour identifier les composants impliqués dans l’initiation de la mort cellulaire ou pour déterminer les effets de différents composants sur le taux d’initiation de la mort cellulaire si les plantes utilisées sont transgéniques et ont des niveaux modifiés de composants d’intérêt.
Le protocole démontré permet à l’utilisateur de déterminer avec précision le taux d’initiation de la mort cellulaire en imageant en continu les feuilles inoculées dans le temps entre l’initiation de la mort cellulaire et l’apparition de la mort cellulaire à l’aide d’un microscope numérique. Même s’il existe de nombreuses façons de surveiller l’apparition des lésions et des maladies des plantes12,13,14,15, ce protocole présente l’avantage d’une mesure indépendante de la lumière sans perturber le rythme circadien de la plante, car la lumière est éteinte entre les mesures.
Après l’inoculation, les plantes doivent pousser à 28 °C pendant 3 jours. Le gène de résistance Ny-1 , qui induit une réponse d’hypersensibilité, est dépendant de la température et, chez les plantes cultivées à des températures plus élevées, conduit à l’avortement de la résistance, qui se manifeste par l’absence de formation de lésions et la propagation systémique du virus3. Après le transfert des plantes à 22 °C, la mort cellulaire est initiée, donc pour des résultats précis, l’observation au microscope numérique doit commencer dès que possible après ce transfert. Une autre étape cruciale dans la préparation de la plante pour l’imagerie est l’immobilisation de la feuille (Figure 1D), car la plante continuera à croître pendant l’imagerie, ce qui pourrait déplacer la feuille observée hors de la mise au point, ou une telle configuration ne donnera pas les résultats souhaités.
Si le protocole décrit est utilisé sur des plantes transgéniques présentant des composants d’intérêt altérés, supposés être impliqués dans l’initiation de la mort cellulaire, le protocole permet à l’utilisateur de déterminer si la diminution du niveau d’un composant étudié affecte le taux d’initiation de la mort cellulaire. Grâce à cela, les composants impliqués dans l’initiation de la mort cellulaire peuvent être identifiés dans les systèmes pathopathiques, où la mort cellulaire programmée se produit, à l’aide de ce protocole. D’autres méthodes d’identification de ces composants sont, par exemple, l’analyse transcriptomique telle que le séquençage de l’ARN ou diverses formes de microscopie, qui peuvent être coûteuses et prendre du temps16. La méthode décrite dans ce protocole permet d’identifier facilement et à moindre coût les composants impliqués dans l’initiation de la mort cellulaire en observant les différences dans les taux d’initiation de la mort cellulaire entre les plantes transgéniques et témoins. Idéalement, dans une telle configuration, deux caméras numériques doivent être utilisées, car une plante transgénique doit être analysée en parallèle avec une usine témoin au sein de la même expérience.
Dans ce protocole, la souche N-Wilga du virus Y a été utilisée ; cependant, d’autres souches de ce virus, par exemple le virus Y marqué par la GFP (PVY-N605(123)-GFP)7, pourraient également être utilisées. De plus, d’autres pathosystèmes, qui entraînent le développement de la mort cellulaire programmée, pourraient être étudiés à l’aide de ce protocole avec des modifications mineures.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Barbara Jaklič pour son assistance technique. Cette recherche a été financée par l’Agence slovène pour la recherche et l’innovation (financement de base de recherche n° P4-0165 et projet Z4-3217 : Déchiffrer l’interconnexion de signalisation liée à l’oxydoréduction dans la résistance de la pomme de terre aux virus).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |