当与头板和与单光子和双光子显微镜兼容的光学设计集成时,微棱镜透镜在测量不同条件下垂直柱中的神经反应方面具有显着优势,包括头部固定状态下的良好控制实验或自由移动动物的自然行为任务。
随着多光子显微镜和分子技术的进步,荧光成像正在迅速发展成为研究活体脑组织结构、功能和可塑性的有力方法。与传统的电生理学相比,荧光显微镜可以捕获细胞的神经活动和形态,从而能够以单细胞或亚细胞分辨率长期记录已识别的神经元群。然而,高分辨率成像通常需要一个稳定的、头部固定的设置,以限制动物的运动,并且制备透明玻璃的平面允许在一个或多个水平面上可视化神经元,但在研究跨不同深度的垂直过程方面受到限制。在这里,我们描述了一种将头板固定和微棱镜相结合的程序,该微棱镜可提供多层和多模态成像。这种手术准备不仅可以进入小鼠视觉皮层的整个柱子,而且允许在头部固定位置进行双光子成像,在自由移动的范式中进行单光子成像。使用这种方法,人们可以对不同皮层中已识别的细胞群进行采样,在头部固定和自由移动状态下记录它们的反应,并跟踪几个月的长期变化。因此,该方法提供了对微电路的全面分析,能够直接比较由良好控制的刺激和自然行为范式引起的神经活动。
体内双光子荧光成像1,2的出现,结合了光学系统中的新技术和转基因荧光指示剂,已成为神经科学中研究活体大脑中复杂结构、功能和可塑性的强大技术3,4.特别是,这种成像方式通过捕获神经元的形态和动态活动,提供了比传统电生理学无与伦比的优势,从而促进了对已识别神经元的长期跟踪5,6,7,8。
尽管具有显著的优势,但高分辨率荧光成像的应用通常需要静态的头部固定设置,从而限制动物的活动能力9,10,11。此外,使用透明玻璃表面可视化神经元将观察限制在一个或多个水平面上,限制了对跨越不同皮层深度的垂直过程动力学的探索12。
为了解决这些局限性,本研究概述了一种创新的外科手术,该手术集成了头板固定、微棱镜和微型镜,以创建具有多层和多模态功能的成像模式。微棱镜允许观察沿皮层柱13,14,15,16的垂直处理,这对于理解信息在通过皮层的不同层时如何处理和转换以及垂直处理在塑料变化过程中如何改变至关重要。此外,它允许在头部固定范式和自由移动的环境中对相同的神经群体进行成像,包括多功能实验设置17,18,19:例如,头部固定通常需要用于控制良好的范式,如感觉知觉评估和2光子范式下的稳定记录,而自由移动为行为研究提供了更自然、更灵活的环境。因此,在两种模式下进行直接比较的能力对于进一步了解能够实现灵活功能响应的微电路至关重要。
从本质上讲,在荧光成像中集成头板固定、微棱镜和微型镜为探索大脑结构和功能的复杂性提供了一个很有前途的平台。研究人员可以在跨越所有皮质层的不同深度对已识别的细胞群进行采样,直接比较它们在良好控制和自然范式中的反应,并监测它们在20个月内的长期变化。这种方法为这些神经群体在不同实验条件下如何相互作用和随时间变化提供了宝贵的见解,为了解神经回路的动态性质提供了一个窗口。
在这里,我们已经展示了在同一神经群体中观察和直接比较头部固定和自由移动条件下神经元的能力。虽然我们演示了在视觉皮层中的应用,但该协议可以适应许多其他大脑区域,包括皮层区域和深核24,25,26,27,28,以及其他数据采集和行为设置29,30<s…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Charu Reddy女士和Matteo Carandini教授(Cortex实验室)对手术方案和转基因小鼠品系共享的建议。我们感谢 Norbert Hogrefe 医生 (Inscopix) 在手术开发过程中的指导和帮助。我们感谢Andreea Aldea女士(Sun Lab)在手术设置和数据处理方面的协助。这项工作得到了Moorfields Eye Charity的支持。
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
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Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
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Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
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MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |