该协议描述了有助于研究ATG9A生物学的各种方法,包括免疫荧光,然后进行图像分析,瞬时过表达考虑,以及使用蛋白质印迹研究ATG9A糖基化状态。
自噬是一种高度保守的途径,细胞用它来维持体内平衡、降解受损的细胞器、对抗入侵的病原体和在病理条件下生存。一组称为ATG蛋白的蛋白质组成了核心自噬机制,并在定义的层次结构中协同工作。近年来的研究提高了我们对自噬途径的了解。最近,有人提出ATG9A囊泡是自噬的核心,因为它们控制着一种称为吞噬团的细胞器的快速 从头 合成。ATG9A的研究已被证明具有挑战性,因为ATG9A是一种跨膜蛋白,并且它存在于不同的膜室中。因此,了解其贩运是理解自噬的重要因素。在这里,提出了可用于研究ATG9A的详细方法,特别是使用免疫荧光技术对其进行定位,可以对其进行评估和量化。还讨论了瞬时过度表达的缺陷。ATG9A功能的正确表征和分析其运输技术的标准化对于进一步表征控制自噬起始的事件至关重要。
ATG9A 是核心自噬机制中唯一的跨膜蛋白,在高尔基体和胞质 ATG9A 囊泡区室之间运输,通过内体区室1 转运。长期以来,ATG9A一直是一个谜,最近被描述为一种脂质加扰酶,因为它平衡了膜双层上的脂质2,3。现在很明显,ATG9A 位于自噬体形成层次结构的顶部,因此,它的研究对于理解自噬至关重要 4,5。因此,ATG9A 囊泡最近被提议作为自噬体 6,7 的“种子”。然而,先前的研究表明,ATG9A仅在其成熟的不同步骤中与形成的自噬体短暂相互作用,并且不会整合到自噬膜中6,8,9,10,11。因此,需要进一步的研究来完全揭示ATG9A在自噬体形成中的作用和潜在的多种功能。然而,当前模型与先前数据之间的差异只能通过使用经过验证的定量方法和细胞内标记物解决ATG9A运输的靶向实验来解决。
有多种工具用于研究 ATG9A,每种工具都有优点和缺点,并且这些工具的使用因 ATG9A 的结构、分子功能和细胞运输而变得复杂 2,8,12。ATG9A 形成同源三聚体,被糖基化,并在整个细胞中运输到高尔基体、内体和质膜等区室13,14。鉴于其复杂的行程,在解释读数方面存在一些挑战,例如ATG9A在特定治疗或刺激(如营养和血清饥饿)下从高尔基体扩散。ATG9A在囊泡运输方面具有极强的动态性;事实上,在饥饿诱导的自噬背景下,含有 ATG9A 的囊泡已被定义为 ATG9A 区室。由这些动态囊泡形成的ATG9A区室与几个细胞内细胞器瞬时相互作用8,15,16,17。本文描述的技术,包括免疫荧光、活体成像和糖基化测定,应有助于检测和理解 ATG9A 生物学。特别是,本文中描述的方法将有助于解决有关定位到特定细胞区室以及与特定蛋白质伴侣和/或膜区室相互作用的问题。由于 ATG9A 疏水保守核心结构域(PFAM 结构域 PF04109)具有独特的拓扑结构和 ATG9A 在多个膜室之间循环,因此研究人员应注意瞬时过表达 ATG9A 时的某些陷阱和伪影,包括但不限于内质网 (ER) 保留。由于蛋白质的错误折叠、正常生长条件下的人工聚集或由于免疫荧光透化方案欠佳而导致的囊泡区室检测不足,可能会出现其他可能的问题。
在对内源性ATG9A进行成像时,必须注意样品制备和图像采集,以确保后续定量分析的质量和数据的正确解释。将本文中描述的技术与标准生化方法(例如此处未描述的免疫沉淀或下拉实验)相结合,应该可以提高我们对ATG9A功能的理解。该实验工具包旨在帮助新研究人员进行一些测定,以确定ATG9A在其生物系统中的功能。
本研究说明了可用于研究 ATG9A 定位的各种工具。首先,本研究描述了如何通过免疫荧光可视化ATG9A以及如何对其进行量化。其次,比较了可用于用荧光标记物标记ATG9A以在固定细胞或活细胞中可视化的策略。最后,本文描述了如何研究和使用 ATG9A 的糖基化状态来确定 ATG9A 是否已经退出内质网并通过高尔基体运输。
关于通过免疫荧光表征内源性ATG9A定位,必须注意实验采用的固定和透化方法。根据此处描述的标准程序,多聚甲醛固定与洋地黄皂苷通透相结合是可视化高尔基体相关 ATG9A 和 ATG9A 阳性囊泡的良好条件7。除了固定和透化外,与一抗溶液一起孵育的时机也至关重要。我们已经观察到,但尚未记录,较高浓度的一抗溶液和较长的孵育时间会导致 ATG9A 的高尔基体染色出现错误描述性增加,最终影响 ATG9A 重新分布到其他膜室的检测。此外,由于 ATG9A 存在于许多细胞内区室1、13、17、22、23、24、27、28 中,因此使用特定的膜标记物和 ATG9A 来识别 ATG9A 的位置非常重要。过去曾使用过几种方法来量化 ATG9A 定位,包括共定位的 Pearson 相关系数29。然而,ATG9A与高尔基体的部分重叠以及明显的囊泡室导致了大量的像素异常值,这可能会使相关系数的解释产生偏差。出于这个原因,首选基于待分析的两个隔室中平均荧光比率的更简单的方法,并且这种方法对细胞间变异性不太敏感。有关通过显微镜进行图像分析的更多信息,请将读者引导至本书第30 章。
在研究ATG9A的糖基化状态时,选择用于运行蛋白质印迹的凝胶非常重要。对于该方案,首选3%-8%Tris-乙酸凝胶,因为它们为较大的蛋白质提供最高分辨率,但也可以使用替代凝胶组合物或电泳缓冲液,以提供高分子量蛋白质的良好分离。实验者可以通过增加电泳时间来确保蛋白质的最大分离。
当制备样品以在蛋白质印迹上可视化ATG9A时,应注意不要在加入Laemmli缓冲液后煮沸样品;在95°C下沸腾诱导ATG9A聚集体的形成,随后,ATG9A不能有效地迁移到凝胶1中。建议在65°C下加热样品5分钟27。
高水平的转染通常会导致 ATG9A 在内质网中的更高积累,而中等表达水平有助于蛋白质的生理定位。有趣的是,72 小时而不是 48 小时的孵育时间通常有助于减少 ER 定位伪影。值得注意的是,mRFP-ATG9A 可以准确报告 ATG9A 运输和功能,如果通过表达水平或使用稳定细胞系8、9、22、27 来控制水平。
过表达的 ATG9A 群体未能获得成熟的 N-连接聚糖可用作 ATG9A 转运受干扰的读数。当突变或删除ATG9A的某些区域时,存在内质网保留增加的风险,这可能导致无法获得成熟的N-连接聚糖,从而导致蛋白质印迹上ATG9A条带迁移更快。使用截短的 ATG9A 构建体的研究人员应检查内质网保留、糖基化状态和高尔基体定位。
对于ATG9A的活细胞成像,Airyscan显微镜依靠快速Airyscan功能,提供通常约为120 nm的最佳分辨率。为了实现定位精度,在超分辨率模式下,帧速率约为每秒 1-2 帧 (fps),具体取决于成像的通道数。类似的可以高速成像的共聚焦显微镜也可用于ATG9A囊泡的成像;但是,应该注意的是,成像速度会直接影响事件的检测,从而影响数据的解释。
总之,所提出的方案描述了通过免疫荧光、活细胞显微镜及其糖基化状态量化和表征ATG9A定位的方法。这些协议可以帮助研究人员使用ATG9A,并帮助避免一些陷阱。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Rocco D’Antuono对手稿的校对,以及自噬分子细胞生物学(MCBA)实验室的所有现任和前任成员的讨论,这些讨论导致了这些协议的完善。A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T, 得到了弗朗西斯·克里克研究所的支持,该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心 (CC2134)、英国医学研究委员会 (CC2134)。这项研究全部或部分由Wellcome Trust(CC2134)资助。出于开放获取的目的,作者已将 CC BY 公共版权许可应用于由此提交产生的任何作者接受的手稿版本。
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |