유럽과 북미에서 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 보렐리아 종의 여러 항원에 대해 유도된 IgG 및 IgM에 대한 혈청 샘플을 동시에 평가하는 비드 기반 다중 면역분석을 개발하기 위해 3채널 이중 리포터 형광 흐름 분석 시스템을 사용했습니다.
감염성 질환의 진행을 모니터링하기 위해서는 다양한 항원 결정 인자에 대한 면역 반응성을 평가하고, 숙주 면역 반응의 여러 단계에서 나타나는 다양한 항체 동형을 측정하는 것이 유용합니다. 라임 보렐리오증(Lyme borreliosis)의 경우, 병원성 병원체는 보렐리아 종의 여러 구성원 중 하나일 수 있습니다. 그러므로, 정확한 표본 분류는 다른 Borrelia 종의 다른 항원에 대하여 면역 반응성을 평가할 것을 요구합니다. 또한 항병원체 IgG 및 IgM 반응은 질병 진행 중에 서로 다른 유도 시간 경과를 가질 수 있습니다. 여기서는 동일한 반응에서 서로 다른 박테리아 항원에 대한 IgG 및 IgM 면역 반응을 동시에 평가하여 인간 혈청 샘플에서 Borrelia 특이적 면역 반응을 식별하는 데 유용한 2-리포터 다중 면역분석법의 개발을 보여줍니다. 이 이중 리포터 접근법은 단일 리포터 분석법의 분석 성능을 유지하면서 시간과 자원을 절약하고 샘플 크기 요구 사항을 줄입니다. 이 분석을 통해 혈액 샘플에서 혈청학적 정보를 절반의 시간에 두 배로 생성할 수 있습니다.
라임 보렐리아증(Lyme borreliosis)은 북반구의 온화한 기후에서 가장 흔한 진드기 매개 전염병이다1. 보렐리야(Borrelia) 속의 스피로헤테(spirochete) 박테리아에 의해 발생하며, 지리적 분포가 다른 5가지 알려진 인간 병원체가 있다2. 유럽의 주요 병원성 보렐리아 종은 B. afzelii 및 B. garinii이며, B. burgdorferi s.s., B. spielmanii 및 B. bavariensis는 덜 자주 연루됩니다. 북아메리카에서는 B. burgdorferi s.s.가 라임 보렐리아증 2,3의 유일한 원인균이다. 보렐리아 병원균은 진드기 속 익소데스(Ixodes)에 속하며, 진드기에 물린 후 24시간 이내에 전염될 수 있다4.
라임 보렐리아증 진단은 일반적으로 임상 증상에 의해 이루어지며 이후 혈청학으로 확인됩니다. 유럽과 북미 모두에서 진단 지침은 보렐리아 특이적 항원 1,5,6,7,8,9에 대한 항체 반응을 평가하기 위해 반사 면역블롯이 있는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)으로 구성된 2단계 테스트 시리즈를 권장합니다 . 그러나 이 접근법은 민감도가 부족하고 특히 혈청전환이 불완전하고 항-보렐리아 IgG 및 IgM 역가가 너무 낮은 감염 초기 단계에서 최적이 아니다6.
멀티플렉스 면역분석법은 한 번에 하나의 표적만 측정하는 기존의 면역분석을 개선하며, 하나 이상의 항원에 대한 여러 항체 동형형 반응을 동시에 평가할 수 있습니다 10,11,12. ELISA와 같은 분석은 반응당 단일 분석물을 식별하고 정량화하는 것으로 제한되며, 현재 보렐리아 감염 후 단일 박테리아 항원에 대해 유도된 순환 IgG 또는 IgM입니다. 이 보고서는 인간 혈청 샘플에서 본 명세서에서 선택한 보렐리아 항원에 대해 IgG 및 IgM 항체를 동시에 검출하는 다중 면역 분석법의 개발을 위해 비드 기반 분석물 프로파일링 기술을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 유럽에서 자생하는 가장 흔한 병원성 보렐리아 종을 함께 포함하는 4개의 항원을 선택했습니다(B. 가리니, B. 아프젤리, B. 부르그도르페리 s.s.) 및 북미 (B. burgdorferi s.s.) (표 1) 2,3입니다. 이를 통해 결정적인 병원체를 식별하고 환자 샘플에서 초기 IgM 및 이후 더 내구성 있는 IgG 면역 반응을 식별할 수 있습니다.
대상 아이소타입 | 리포터 채널 | 항원 | 보렐리아 종 | 거르다 | 항원 커플링 농도 |
이그엠 | 체육 | 오피씨 | B. 가리니 | 20047 | 5.0μg/6 비드 10개 |
IgG (이그지) | BV421 시리즈 | VlsE | B. burgdorferi s.s | 나31 | 1.25μg/6 비드 10개 |
IgG (이그지) | BV421 시리즈 | 디비파이 | B. burgdorferi s.s. | ZS7 시리즈 | 10.0μg/10 6 비드 |
IgG (이그지) | BV421 시리즈 | 디비파이 | B. 아프젤리 | PKo (피코) | 5.0μg/6 비드 10개 |
표 1: 멀티플렉스 분석 개발에 사용되는 대표적인 보렐리아 항원.
우리는 처음에 두 개의 개별 반응에서 항 보렐리아 항원 IgG 또는 IgM 항체를 검출하는 단일 리포터 면역분석을 개발한 다음 이러한 분석을 동일한 반응 혼합물에서 두 항체 동형을 모두 측정하는 듀얼 리포터 다중 분석으로 병합했습니다. 마그네틱 비드는 관심 병원체 표적 항원에 결합된 다음 환자 혈청 샘플과 함께 배양됩니다. 비드 결합 항원은 병원체 항원에 대한 면역 반응에서 생성된 혈청에서 순환하는 IgG와 IgM에 의해 인식되고 포착됩니다. 분석 IgG 대 IgM 특이성은 각각 두 개의 2차 항체와 관련된 뚜렷한 형광단 신호를 가진 IgG 또는 IgM에 결합하는 2차 항체의 선택에 의해 결정됩니다. 각 형광 신호는 IgG 또는 IgM(여기서는 각각 Brilliant Violet 421 또는 phycoerythrin)을 검출하는 데 사용되는 단일 형광단에 특화된 서로 다른 여기 레이저 및 방출 캡처가 있는 기기의 두 Reporter 채널(즉, 듀얼 리포터) 중 하나에서 검출됩니다. 기기 분류 채널은 다양한 비드 세트에 내재된 색상으로 구분된 염료를 식별합니다. 따라서, 여러 표적 항원을 서로 다르게 염색된 비드에 결합할 수 있으며, 비드 세트를 함께 혼합하여 혈청 샘플에서 다양한 항병원체 면역 활성을 종합적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분류 채널은 각 개별 비드 세트(즉, 특정 항원)를 식별하고 해당 항원에 대한 IgG 또는 IgM과 관련된 형광을 측정합니다. 그 결과 멀티플렉스 분석은 덜 포괄적인 기존 검사에 비해 시간과 자원을 절약하고 제한된 샘플 부피에서 라임 면역 반응을 정확하게 분류합니다. SARS-CoV-2 감염13과 같은 다른 병리학에서 면역 반응을 분류하기 위해 유사한 이중 보고자 접근 방식이 이전에 사용되었지만, 이 보고서에서는 라임 보렐리오증의 면역 반응을 특성화하기 위한 다중 형광 분석 기술의 적용에 대해 자세히 설명합니다.
이 보고서는 혈청 샘플에서 항 보렐리아 면역 활성을 재현 가능하고 민감하게 결정하는 2 리포터 비드 기반 보렐리아 면역 분석법의 개발을 강조합니다12. 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 병원성 보렐리아 종은 변이체 특이적 항원 이질성 6,7,8,9에 의해 구별될 수 있다. 다중 분석은 동일한 반응 웰 내에서 IgG 및 IgM 매개 항 보렐리아 면역 활성을 동시에 평가하여 두 개의 단일 분석 분석을 별도로 수행하는 데 필요한 시약, 노동력 및 샘플 재료를 보존합니다. 시간 경과에 따른 IgM 반응과 IgG 반응을 비교하면 감염 후 IgM에서 IgG로의 혈청전환이 발생함에 따라 질병 진행을 더 잘 추적할 수 있다6.
이중 리포터 시스템은 두 개의 서로 다른 검출 항체 시스템(13,15)을 사용한다. 관련 실험에서는 두 항체 등급이 동일한 반응 웰에서 함께 분석되었을 때 Borrelia 항-IgM 및 항-IgG 검출 시스템 간에 유의미한 검출 가능한 교차 반응성이 없음을 보여주었습니다12. IgG 항체16,17에 비해 IgM의 낮은 결합 친화도를 고려하여, PE는 면역분석에서 일상적으로 사용되는 가장 강력한 방출 형광단 중 하나이기 때문에 IgM 검출을 위해 PE 접합 검출 항체(이중 리포터 기기의 첫 번째 리포터 채널)를 선택했습니다18. IgG 평가를 위해 비오틴화 검출 항체를 사용했으며, 이후 BV421 접합 스트렙타비딘(기기의 두 번째 리포터 채널)19으로 조명했습니다. 단일 리포터 시스템에 비해 30분의 추가 배양 단계에도 불구하고 듀얼 리포터 시스템은 반응당 두 배의 정보를 제공합니다. 전반적으로, 이중 리포터 다중 분석은 두 개의 단일 리포터 분석을 실행하는 것보다 누적 시간과 재료 투입이 덜 필요합니다.
다중화 Borrelia 분석의 강력한 성능과 안정성은 intra- 및 inter-assay 정밀 연구에서 높은 재현성, 그리고 IgG 및 IgM 평가 모두에 대한 광범위한 샘플 농도에 대한 희석 선형성 및 희석 평행성의 시연에 의해 예시되었습니다. 단일 채널 기기를 사용하는 동일한 형광단에 대해 이중 채널 시스템에 비해 더 높은 절대 형광 방출 수준을 관찰했으며(PE의 경우 ≈1.7× 더 높음), 이는 두 기기 간의 광학 및 보정 설정의 차이에 기인합니다(그림 4). 그럼에도 불구하고, 두 형광단을 가진 형광 방출 곡선은 높고 낮은 표본 희석 극단에 두 계기 전부의 선형 범위 안에 남아 있었고, 측정된 절대 형광에 있는 어떤 어긋도 Borrelia 노출 상태의 분류에 영향을 미치지 않았다. 12의
이 비드 기반 보렐리아 멀티플렉스 분석의 주요 장점은 분석이 다른 또는 추가 분석물을 평가하기 위해 수정되거나 확장될 수 있는 용이성입니다., 예를 들어, 추가 보렐리아 종의 항원에 대한 항체를 검출하기 위해. xMAP 마그네틱 비드 세트에는 기기의 분류 채널에서 구별할 수 있는 다양한 염료 조합이 포함되어 있으며, 이론적으로 동일한 시료 내에서 최대 500개의 고유한 분석물을 동시에 평가할 수 있는 멀티플렉스 분석으로 구현할 수 있습니다. 현재 연구는 분석 기능 및 안정성을 입증하고 단일 및 이중 보고자 시스템을 비교하기 위해 4개의 대표적인 보렐리아 항원을 강조하는 반면, 최종 분석은 유럽과 북미 전역에 순환하는 5개의 임상 관련 보렐리아 병원체를 모두 식별할 수 있는 8개의 항원을 조사합니다12.
반자동 분석 형식의 표준 384웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 고처리량 성능을 발휘할 수 있습니다. 96웰 및 384웰 플레이트와의 분석 및 기기 호환성을 통해 Borrelia 멀티플렉스 분석은 국가 연구20과 같은 대규모 샘플 세트를 신속하게 분석하기 위한 효율적인 스크리닝 도구로 사용할 수 있습니다. 분석의 수동 수행은 더 작은 96웰 플레이트를 사용하는 더 작은 샘플 세트에 대해 여전히 가능합니다.
연구 한계에는 소수의 인간 혈청 샘플에서 소수의 보렐리아 면역 반응 표적만 비교 평가가 포함됩니다. 그러나, 본래 학문은 IgG와 IgM 둘 다를 위한 분석 성과가 더 큰 표본 세트12 내의 모든 5개의 알려진 Borrelia 종에서 8개의 항원을 분석할 때 유지된다는 것을 확인했다. 또한 이중 리포터 기기는 각 반응 내에서 두 개의 항체 동형만 동시에 평가할 수 있으므로 완전한 동형 프로파일링을 위해서는 추가 분석 반응을 수행해야 합니다13.
결론적으로, 이 보고서는 인간 혈청 샘플에서 병원성 Borrelia 특이적 IgG 및 IgM 항체를 동시에 평가할 수 있는 이중 리포터 분석법으로 bead-based single-reporter immunoassay의 성공적인 병합 및 전환에 대해 자세히 설명합니다. 이 결합된 접근 방식은 총 시간, 재료 및 인력 투입을 절약하여 두 개의 독립적인 단일 리포터 분석과 동일한 데이터 볼륨을 생성합니다. 멀티플렉스 분석은 96웰에서 384웰 마이크로타이터 플레이트 형식으로 확장할 수 있으며 로봇 플레이트 및 액체 처리 기기를 사용하여 반자동화할 수 있어 대규모 인구 조사와 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다. 비드 기반 이중 리포터 분석 시스템은 예를 들어 다른 바이러스 및 박테리아 병원체에 대한 면역 반응을 평가하고13,21 장기 이식에서 HLA 에피토프에 대한 동종 항체 반응을 평가하고22 자가면역 질환의 메커니즘을 탐색하는 데 유용성을 입증했습니다23. 현재 보고서는 실험실이 다양한 병리학에서 복잡한 면역 메커니즘을 탐구하기 위해 이 접근 방식을 적용할 수 있는 방법의 예로서 라임병을 유발하는 보렐리아 병원체에 대한 노출을 식별하기 위해 다중 기술을 사용하는 방법을 자세히 설명했습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 보고서는 Luminex(텍사스 주 오스틴)의 지원을 받았습니다. 저자는 분석 및 과학 편집에 도움을 준 Matthew Silverman PhD(Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL, mattsilver@yahoo.com)에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 연구에 사용된 보렐리아 항원을 제공한 tgcBIOMICS GmbH(Bingen, Germany)의 Harald Klein과 Christoph von Eichel-Streiber에게 감사를 표합니다. 기술 분석 검증 및 품질 관리를 위한 인간 혈청 샘플은 다음에서 얻었습니다: 1) 독일 브라운슈바이크에 있는 헬름홀츠 감염 연구 센터 역학과를 통해 독일의 SARS-CoV-2에 대한 항체에 대한 다국소 및 연속 유병률 연구; 2) Sächsisches Krankenhaus Rodewisch(독일 Rodewisch) 신경과. 인체 샘플 사용에 대한 승인은 독일 하노버 의과대학 윤리위원회(9086_BO_S_2020)에서 승인되었습니다.
Antibodies and Detection Reagents | Source | Catalog Number | |
Biotinylated Goat Anti-Human IgG | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 109-066-098 | |
Brilliant Violet 421-Streptavidin | BD Biosciences | 563259 | |
Donkey Anti-Human IgM | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 709-116-073 | |
Borrelia Antigens | tgcBIOMICS (Bingen, Germany) | ||
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific Pierce | 77149 ProteoChem (100 mg) | |
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
BSA | Carl Roth | T844.3 | |
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) | Carl Roth | 4256.2 | |
Na2HPO4 | Carl Roth | 4984.1 | |
ProClin300 | Sigma | 48914-U | |
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Scientific Pierce | 24510 (500 mg) | |
Triton X-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | Source | ||
384-well plate | Corning, Cat# 3570 | ||
96-well deep-well plates | ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450 | ||
96-well half-area plates | Corning, Cat# 3690 | ||
BioTek 405 TS Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
BioTek MultiFlo FX Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) | ThermoFisher, Cat# 12320D | ||
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) | ThermoFisher, Cat# A31508 | ||
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
SmartBlock Plates | Eppendorf, Cat# 5363000039 | ||
ThermoMixer C | Eppendorf, Cat# 5382000015 | ||
ThermoTop | Eppendorf, Cat# 5308000003 | ||
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX |