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遺伝学

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65316
, , , ,
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

概要

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Abstract

A transcrição espacial temporal de genes é fortemente regulada por elementos regulatórios distais, como intensificadores e silenciadores, que dependem da proximidade física com seus promotores gênicos alvo para controlar a transcrição. Embora esses elementos regulatórios sejam fáceis de identificar, seus genes-alvo são difíceis de prever, uma vez que a maioria deles é específica do tipo celular e pode ser separada por centenas de quilobases na sequência linear do genoma, pulando sobre outros genes não-alvo. Por vários anos, o Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) tem sido o padrão-ouro para a associação de elementos regulatórios distais aos seus genes-alvo. No entanto, a PCHi-C depende da disponibilidade de milhões de células, proibindo o estudo de populações celulares raras, como as comumente obtidas de tecidos primários. Para superar essa limitação, foi desenvolvido o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um método econômico e personalizável para identificar o repertório de elementos regulatórios distais que controlam cada gene do genoma. O liCHi-C baseia-se em uma estrutura experimental e computacional semelhante à PCHi-C, mas empregando mudanças mínimas de tubo, modificando a concentração e os volumes do reagente e trocando ou eliminando etapas, ele é responsável por uma perda mínima de material durante a construção da biblioteca. Coletivamente, o liCHi-C possibilita o estudo da regulação gênica e da organização espaço-temporal do genoma no contexto da biologia do desenvolvimento e da função celular.

Introduction

A expressão gênica temporal impulsiona a diferenciação celular e, em última instância, o desenvolvimento do organismo, e sua alteração está intimamente relacionada a uma ampla gama de doenças1,2,3,4,5. A transcrição gênica é finamente regulada pela ação de elementos regulatórios, que podem ser classificados em proximais (i.e., promotores gênicos) e distais (e.g., intensificadores ou silenciadores), estes últimos frequentemente localizados distantes de seus genes-alvo e interagindo fisicamente com eles através de looping de cromatina para modular a expressão gênica 6,7,8.

A identificação de regiões reguladoras distais no genoma é uma questão amplamente consensual, uma vez que essas regiões abrigam modificações específicas de histonas 9,10,11 e contêm motivos específicos de reconhecimento de fatores de transcrição, atuando como plataformas de recrutamento para elas12,13,14. Além disso, no caso dos intensificadores e superpotencializadores 15,16, eles também apresentam baixa ocupação nucleossômica 17,18 e são transcritos em eRNAs não codificantes 19,20.

No entanto, os genes-alvo de cada elemento regulatório distal são mais difíceis de prever. Na maioria das vezes, as interações entre os elementos regulatórios distais e seus alvos são do tipo celular e estímulo específico 21,22, abrangem centenas de quilobases, fazendo ponte com outros genes em qualquer direção 23,24,25, podendo inclusive estar localizadas dentro de regiões intrônicas de seu gene alvo ou de outros genes não intervenientes 26,27. Além disso, elementos reguladores distais também podem controlar mais de um gene ao mesmo tempo, evice-versa28,29. Essa complexidade posicional dificulta a identificação de associações regulatórias entre eles e, portanto, a maioria dos alvos de cada elemento regulatório em cada tipo celular permanece desconhecida.

Durante os últimos anos, houve um boom significativo no desenvolvimento de técnicas de captura de conformação cromossômica (3C) para estudar interações com cromatina. O mais utilizado deles, o Hi-C, permite gerar um mapa de todas as interações entre cada fragmento do genoma de uma célula30. No entanto, para detectar interações significativas no nível de fragmento de restrição, o Hi-C depende de sequenciamento ultraprofundo, proibindo seu uso para estudar rotineiramente o cenário regulatório de genes individuais. Para superar essa limitação econômica, várias técnicas 3C baseadas em enriquecimento surgiram, como ChIA-PET31, HiChIP 32 e sua contraparte de baixa entrada HiCuT33. Essas técnicas dependem do uso de anticorpos para enriquecer interações genômicas mediadas por uma proteína específica. No entanto, a característica única dessas técnicas 3C é também a banalidade de sua aplicação; Os usuários contam com a disponibilidade de anticorpos de alta qualidade para a proteína de interesse e não podem comparar condições em que a ligação da proteína é dinâmica.

O Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) é outra técnica 3C baseada em enriquecimento que contorna essas limitações34,35. Ao empregar um sistema de enriquecimento de sonda de RNA biotinilado, o PCHi-C é capaz de gerar bibliotecas genômicas de alta resolução de regiões genômicas interagindo com 28.650 promotores de genes humanos ou 27.595 anotados em camundongos, também conhecidos como interactome promotor. Esta abordagem permite detectar interações significativas de longo alcance na resolução do nível de fragmento de restrição de promotores ativos e inativos, e comparar robustamente os interátomos promotores entre qualquer condição, independentemente da dinâmica de modificações de histonas ou ligação de proteínas. A PCHi-C tem sido amplamente utilizada nos últimos anos para identificar reorganizações interatomas promotoras durante a diferenciação celular 36,37, identificar o mecanismo de ação dos fatores de transcrição38,39 e descobrir novos potenciais genes e vias desreguladas na doença por variantes não codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, ao lado de novas mutações não codificadoras 49,50. Além disso, apenas modificando o sistema de captura, essa técnica pode ser personalizada de acordo com a questão biológica para interrogar qualquer interatoma (por exemplo, o interatoma intensificador 51 ou o interatoma de uma coleção de alterações não codificantes41,52).

No entanto, a PCHi-C depende de um mínimo de 20 milhões de células para realizar a técnica, o que impede o estudo de populações celulares escassas como as frequentemente usadas em biologia do desenvolvimento e aplicações clínicas. Por esta razão, desenvolvemos o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um novo método econômico e personalizável baseado na estrutura experimental do PCHi-C para gerar interatomas promotores de alta resolução com entrada de baixa célula. Realizando o experimento com trocas mínimas de tubo, trocando ou eliminando etapas do protocolo PCHi-C original, reduzindo drasticamente os volumes de reação e modificando as concentrações de reagentes, a complexidade da biblioteca é maximizada e é possível gerar bibliotecas de alta qualidade com apenas 50.000 células53.

O Low input Capture Hi-C (liCHi-C) tem sido comparado com PCHi-C e usado para elucidar a religação do interatoma promotor durante a diferenciação de células hematopoéticas humanas, descobrir potenciais novos genes e vias associadas à doença desreguladas por alterações não-codificantes e detectar anormalidades cromossômicas53. O passo-a-passo do protocolo e os diferentes controles de qualidade através da técnica são detalhados aqui até a geração final das bibliotecas e sua análise computacional.

Protocol

Para garantir uma perda mínima de material, (1) trabalhar com tubos e pontas de baixa ligação de ADN (ver Tabela de Materiais), (2) colocar reagentes na parede do tubo em vez de introduzir a ponta no interior da amostra e, (3) se possível, misturar a amostra por inversão em vez de pipetar a amostra para cima e para baixo, e girar para baixo depois para recuperar a amostra. 1. Fixação celular Células crescendo em suspensãoColher 50.00…

Representative Results

O liCHi-C oferece a possibilidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor genômico de alta qualidade e resolução com apenas 50.000 células53. Isso é conseguido por – além da redução drástica dos volumes de reação e do uso de plástico de baixa ligação de DNA em todo o protocolo – removendo etapas desnecessárias do protocolo original, nas quais ocorrem perdas significativas de material. Estes incluem a purificação de fenol após a desreticulação, a remoção de biotina e s…

Discussion

O liCHi-C oferece a capacidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta resolução usando uma estrutura experimental semelhante à da PCHi-C, mas com um número de células muito reduzido. Isso é muito conseguido eliminando etapas desnecessárias, como purificação de fenol e remoção de biotina. No protocolo clássico de ligadura intranúcleo Hi-C57 e sua subsequente técnica derivada PCHi-C, a biotina é removida de fragmentos de restrição não ligados para evitar puxar para bai…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao resto dos membros do laboratório Javierre por seu feedback sobre o manuscrito. Agradecemos ao Programa CERCA, à Generalitat de Catalunya e à Fundação Josep Carreras pelo apoio institucional. Este trabalho foi financiado pelo FEDER/Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (RTI2018-094788-A-I00), pela Associação Europeia de Hematologia (4823998) e pela Associação Espanhola contra o Câncer (AECC) LABAE21981JAVI. O BMJ é financiado pelo projeto Líder Júnior da Fundação Bancária La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), o LR é financiado por uma bolsa AGAUR FI (2019FI-B00017) e o LT-D é financiado por uma bolsa FPI (PRE2019-088005). Agradecemos ao programa de doutorado em bioquímica e biologia molecular da Universitat Autònoma de Barcelona pelo apoio. Nenhum dos financiadores esteve envolvido em nenhum momento do desenho experimental ou da redação do manuscrito.

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies – Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies –
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
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参考文献

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LiCHi-CChromatin InteractionsGenome OrganizationGene RegulationRegulatory ElementsPromoter-centricSpatiotemporalRare Cell PopulationsLow InputCapture Hi-C

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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).
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