Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica ^1,2,3.

A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentrações, mas coalescem em lentes de óleo que crescem e brotam em gotículas quase esféricas da membrana de RE quando sua concentração intracelular aumenta⁴. Posteriormente, proteínas da bicamada de RE e do citosol, particularmente da família de proteínas perilipina (PLIN), translocam-se para as superfícies dos DLs para facilitar o brotamento 5,6,7,8,9.

Através de nova síntese de ácidos graxos e fusão ou coalescência de LD, LDs crescem em diferentes tamanhos. Assim, o tamanho e o número de LDs diferem consideravelmente entre os diferentes tipos de células. Pequenas gotículas (300-800 nm de diâmetro), conhecidas como DLs iniciais (iLDs), podem ser formadas por quase todas as células⁴. Mais tarde na formação de LD, a maioria das células é capaz de converter algumas iLDs em LDs maiores de expansão (eLDs >1 μm de diâmetro). No entanto, apenas tipos celulares específicos, como adipócitos e hepatócitos, têm a capacidade de formar LDs gigantes ou superdimensionadas (até dezenas de mícrons de diâmetro)^4,10.

Os DLs desempenham um papel muito importante na regulação do metabolismo lipídico celular, suprimindo a lipotoxicidade e prevenindo o estresse de RE, a disfunção mitocondrial e, finalmente, a morte celular causada pelos ácidos graxos livres (AGs)^11,12,13,14. Além disso, as DLs também têm sido implicadas na regulação da expressão gênica, no sequestro de proteínas de replicação viral, no tráfego e sinalização de membranas^15,16,17. Portanto, a desregulação da biogênese da DL é uma característica das doenças crônicas associadas à síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e/ou arteriosclerose, para citar apenas algumas^18,19,20.

O fígado, como polo metabólico, é o principal responsável pelo metabolismo lipídico, armazenando e processando lipídios, sendo, portanto, constantemente ameaçado pela lipotoxicidade²¹. A esteatose hepática (EH) é uma característica comum a uma série de doenças hepáticas progressivas e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de lipídios intracelulares na forma de LDs citosólicos que, em última instância, podem levar à disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica^22,23,24,25. A SH ocorre quando a taxa de oxidação de ácidos graxos e exportação como triglicerídeos dentro de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs) é menor do que a taxa de captação de ácidos graxos hepáticos do plasma e síntese de novos ácidos graxos²⁶. O acúmulo hepático de lipídios frequentemente ocorre em duas formas – esteatose microvesicular e macrovesicular – e estas apresentam características citoarquitetônicas^distintas27. Tipicamente, a esteatose microvesicular é caracterizada pela presença de pequenos DLs dispersos por todo o hepatócito com o núcleo posicionado centralmente, enquanto a esteatose macrovesicular é caracterizada pela presença de um único grande DL que ocupa a maior parte do hepatócito, empurrando o núcleo para a periferia^28,29. Notavelmente, esses dois tipos de esteatose são frequentemente encontrados juntos, e ainda não está claro como esses dois padrões de DL influenciam a patogênese da doença, pois as evidências ainda são inconsistentes^31,32,33,34. No entanto, esse tipo de análise é frequentemente empregado como “padrão de referência” em estudos pré-clínicos e clínicos para entender o comportamento dinâmico dos DLs e caracterizar a esteatose hepática29,34,35,36.

As biópsias hepáticas, padrão-ouro para o diagnóstico e classificação da EH, são rotineiramente avaliadas pela análise histológica de hematoxilina e eosina (H&E), onde gotículas lipídicas são avaliadas como vacúolos não corados em cortes hepáticos corados por H&^E37. Embora aceitável para avaliação da esteatose macrovesicular, esse tipo de coloração geralmente estreita a avaliação da esteatose microvesicular³⁸. Corantes diazo lipossolúveis, como o Oil Red O (ORO), são classicamente combinados com microscopia de campo claro para analisar os estoques lipídicos intracelulares, mas estes ainda apresentam uma série de desvantagens: (i) o uso de etanol ou isopropanol no processo de coloração, o que muitas vezes causa a ruptura dos LDs nativos e fusão ocasional apesar das células estarem fixas³⁹; (ii) a natureza demorada, uma vez que a solução de ORO requer dissolução e filtragem de pó fresco devido ao prazo de validade limitado, contribuindo assim para resultados menos consistentes; (iii) e o fato de que a ORO cora mais do que apenas gotículas lipídicas e muitas vezes superestima a esteatose hepática³⁸.

Consequentemente, fluoróforos lipofílicos permeáveis a células, como o Nile Red, têm sido usados em amostras vivas ou fixas para superar algumas das limitações mencionadas. No entanto, a natureza inespecífica da marcação de organelas lipídicas celulares restringe repetidamente as avaliações de DL⁴⁰. Além disso, as propriedades espectrais do Vermelho do Nilo variam de acordo com a polaridade do ambiente, o que muitas vezes pode levar a deslocamentos espectrais⁴¹.

A sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (comprimento de onda de excitação: 480 nm; emissão máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) apresenta características de hidrofobicidade que permitem sua rápida captação pelos LDs intracelulares, acumula-se no núcleo lipídico das gotículas e, posteriormente, emite fluorescência verde brilhante¹². Ao contrário do Nile Red, o BODIPY 493/503 é insensível à polaridade do ambiente e tem se mostrado mais seletivo, pois exibe alto brilho para imagens LD. Para corar LDs neutros, esse corante pode ser usado em células vivas ou fixas e acoplado com sucesso a outros métodos de coloração e/ou marcação⁴². Outra vantagem do corante é que ele requer pouco esforço para ser colocado em uma solução e é estável, eliminando a necessidade de prepará-lo na hora para cada experimento⁴². Embora a sonda BODIPY 493/503 tenha sido empregada com sucesso para visualizar a localização e dinâmica de DLs em culturas celulares, alguns relatos também demonstraram o uso confiável desse corante como ferramenta de imagem de DL em tecidos, incluindo o músculo vasto lateral humano⁴³, o músculo sóleo de rato 42 e o intestino de camundongo⁴⁴.

Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em BODIPY 493/503 como uma abordagem analítica alternativa para a avaliação do número, área e diâmetro de DL em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática. Esse procedimento abrange o preparo de amostras de fígado, corte tecidual, condições de coloração, aquisição de imagens e análise de dados.