Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati per RNA-seq a nucleo singolo, ATAC-seq e multiomici articolari (RNA-seq e ATAC-seq).
Il fegato è un tessuto complesso ed eterogeneo responsabile dello svolgimento di molte funzioni fisiologiche critiche, come il mantenimento dell’omeostasi energetica e il metabolismo degli xenobiotici, tra gli altri. Questi compiti vengono eseguiti attraverso uno stretto coordinamento tra cellule parenchimali epatiche e non parenchimali. Inoltre, varie attività metaboliche sono limitate ad aree specifiche del lobulo epatico, un fenomeno chiamato zonazione epatica. I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento a singola cellula hanno permesso ai ricercatori di studiare l’eterogeneità dei tessuti a una risoluzione a singola cellula. In molti tessuti complessi, incluso il fegato, duri protocolli di dissociazione enzimatica e / o meccanica possono influenzare negativamente la vitalità o la qualità delle sospensioni unicellulari necessarie per caratterizzare in modo completo questo organo in salute e malattia.
Questo documento descrive un protocollo robusto e riproducibile per isolare i nuclei da tessuti epatici congelati e archiviati. Questo metodo produce nuclei di alta qualità compatibili con gli approcci omici a valle a singola cellula, tra cui RNA-seq a singolo nucleo, test per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq), nonché omiche multimodali (RNA-seq congiunto e ATAC-seq). Questo metodo è stato utilizzato con successo per l’isolamento di nuclei da campioni di fegato congelato di primati umani sani e malati. Questo approccio consente l’isolamento imparziale di tutti i principali tipi di cellule nel fegato e, quindi, offre una solida metodologia per studiare il fegato alla risoluzione di una singola cellula.
La genomica monocellulare sta rapidamente diventando una metodologia essenziale per studiare la funzionalità epatica e valutare l’impatto dell’eterogeneità cellulare nelle condizioni di salute e malattia1. Il rapido sviluppo della “multiomica” per la misurazione simultanea di diversi strati di informazioni e l’espansione parallela di robuste pipeline computazionali sta aprendo la strada alla scoperta di tipi e sottotipi di cellule precedentemente sconosciuti nel fegato normale e malato2.
La possibilità di esplorare biobanche e campioni congelati archiviati ha aumentato significativamente le opportunità di rivisitare e scoprire il ruolo delle cellule non parenchimali 3,4,5 e indagare il ruolo degli epatociti poliploidi durante l’invecchiamento e nelle malattie croniche 6,7,8,9 . Pertanto, questo articolo descrive un protocollo di isolamento a singolo nucleo robusto e riproducibile per fegati archiviati congelati (FF) che è compatibile con il sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo a valle e il sequenziamento ATAC, nonché con omiche multimodali (RNA-seq congiunto e ATAC-seq) (Figura 1).
Questo flusso di lavoro consente lo studio del trascrittoma e dell’accessibilità della cromatina di tutti i tipi di cellule nel fegato, indipendentemente dalle dimensioni o dalla fragilità della cellula, nei protocolli di dissociazione enzimatica. Può essere eseguita con piccole sezioni di tessuto (15-30 mg o 5-10 mm3) da preziosi campioni umani o topi transgenici. La determinazione dell’elevata purezza dell’isolamento dei nuclei include la quantificazione e la misurazione della dimensione nucleare, che potrebbe essere correlata con l’aumento delle dimensioni cellulari e della senescenza 10,11, e questa purezza è rilevante per l’analisi sia della ploidia degli epatociti 12 che dei meccanismi trascrizionali dipendenti dalla dimensione cellulare11,13,14,15 . Inoltre, i nuclei isolati dai fegati congelati conservano preziose informazioni sulla zonazione del fegato. Il flusso di lavoro e la raccolta dei tessuti consentono la convalida di dati genomici a singola cellula o ulteriori analisi complementari, come l’immunoistochimica o la trascrittomica spaziale dallo stesso tessuto e dallo stesso individuo. Pertanto, questo approccio può essere applicato a più condizioni di malattia epatica e organismi modello in modo sistematico e affidabile.
La dissezione della composizione cellulare del fegato mediante RNA-seq a singola cellula o a singolo nucleo fornisce una comprensione più profonda dello sviluppo e della progressione della malattia epatica 3,4,5,24. L’isolamento di singole cellule dal fegato richiede molto tempo e richiede protocolli che comportano una dura dissociazione meccanica o enzimatica25,26,27. È ampiamente accettato che ogni tessuto richiede una valutazione sistematica per determinare il protocollo ottimale di dissociazione tissutale, nonché un metodo di conservazione adatto per catturare tipi di cellule o nuclei fragili28. A seconda della disponibilità tissutale, della malattia di interesse, dello stadio di sviluppo o dell’organismo modello, la preparazione di una sospensione a nucleo singolo per l’elaborazione a valle potrebbe essere una metodologia più adatta rispetto all’utilizzo di sospensioni unicellulari. È importante sottolineare che, nel fegato, scRNA-seq e snRNA-seq hanno mostrato un’alta correlazione tra mRNA nucleare e citoplasmatico, suggerendo che entrambi gli approcci presentano informazioni complementari 2,3,4,6,29.
Questo documento fornisce un isolamento standardizzato, robusto e riproducibile di un singolo nucleo da campioni di fegato congelati e archiviati di topi e altre specie, inclusi esseri umani e macachi. Questo metodo può essere utilizzato per topi wild-type alimentati con chow e una dieta ricca di grassi (HFD) e per modelli murini di fibrosi epatica utilizzando approcci genomici a singolo nucleo sia a base di piastre che a base di goccioline6. Questo metodo si basa sul protocollo descritto originariamente per il tessuto cerebrale da Krishnaswami et al.30 con ulteriori modifiche su misura per il fegato congelato. L’omogeneizzazione ottimale libera la maggior parte dei nuclei dal tessuto senza influire negativamente sull’integrità della membrana nucleare. L’overdouncing, tuttavia, può danneggiare i nuclei fragili e diminuire la loro qualità complessiva. I fegati giovani e / o grassi di solito richiedono solo 5 colpi con pestello A e 10 colpi con pestello B, mentre fegati vecchi e / o fibrotici potrebbero richiedere 15 colpi con pestello B ma non di più. Non è raccomandato, quindi, eseguire più tratti oltre i numeri qui indicati. L’overdouncing potrebbe influire negativamente sulla qualità della sospensione a singolo nucleo e aumentare la quantità di RNA ambientale. Successivamente, ciò potrebbe comportare la necessità di eseguire ulteriori passaggi di filtraggio computazionale durante le analisi dei dati a valle.
Il protocollo qui presentato è versatile e può essere adattato a diverse condizioni del fegato in topi giovani (3 mesi) e anziani (24 mesi). Poiché abbiamo scoperto che una sezione più ampia del fegato è necessaria per i tessuti vecchi, HFD e fibrotici, la dimensione del tessuto disponibile per la lavorazione può rappresentare una limitazione per alcuni utenti con minori quantità di materiale biologico iniziale. Tuttavia, la purificazione del gradiente è altamente raccomandata per l’elaborazione immediata dei campioni con saggi genomici basati su goccioline. Se i nuclei devono essere FACS ordinati in piastre da 96/384 pozzetti per saggi ben basati, la purificazione del gradiente può essere omessa. Incoraggiamo gli utenti a eseguire ancora la purificazione del gradiente se c’è abbastanza campione di tessuto per ottenere la concentrazione di nuclei raccomandata per lo smistamento FACS (cioè ~ 1 × 105 nuclei / ml).
Il fegato è caratterizzato dalla natura poliploide degli epatociti9, ma il ruolo della ploidia degli epatociti nella normale fisiologia e malattia non è ancora chiaro. C’è un numero crescente di prove che indicano che la ploidia fornisce variabilità genomica31, ed è ben noto che la ploidia aumenta con l’etàdi 32,33 anni. L’arricchimento degli epatociti tetraploidi mononucleati, tuttavia, è anche clinicamente associato a prognosi infausta nel carcinoma epatocellulare umano (HCC)34. Allo stesso modo, i cambiamenti nei livelli di ploidia degli epatociti sono legati a malattie croniche del fegato correlate all’invecchiamento come la steatosi epatica non alcolica (NAFLD)35,36,37. La ploidia è la condizione di possedere più di due copie del genoma, che può essere esplorata colorando il contenuto del genoma con un colorante del DNA come Hoechst38. Il colorante Hoechst, che viene aggiunto all’HB prima dell’estrazione, etichetta tutti i nuclei durante il protocollo di isolamento. Ciò consente di distinguere tra nuclei diploidi e poliploidi in base al loro contenuto di DNA quando eccitati da un laser UV (350 nm) o viola (450 nm) su uno strumento di citometria a flusso. Con la strategia di gating presentata, 2n, 4n, 8n e livelli più elevati di ploidia degli epatociti possono essere studiati in fegati congelati e archiviati per comprendere meglio il ruolo dell’eterogeneità cellulare nella funzione tissutale1 (Figura 3A). Inoltre, la morfologia nucleare, comprese le dimensioni e il volume, può essere quantificata utilizzando la citometria a flusso di imaging per correlare i cambiamenti nella dimensione del nucleo con i cambiamenti nel numero totale di conteggi o nel numero di geni a seconda del livello di ploidia (Figura 3B, C).
La misurazione dell’omica multimodale offre l’opportunità di studiare contemporaneamente diversi livelli di organizzazione genomica. L’approccio multiomico congiunto RNA + ATAC consente lo studio dei regolatori a monte e dei geni metabolici a valle, fornendo un approccio completo per lo studio delle reti trascrizionali e dell’architettura della cromatina associata alla funzionalità epatica alla risoluzione di una singola cellula. Inoltre, con i progressi nei metodi computazionali che possono spiegare la scarsità dei dati e la riduzione dei costi di sequenziamento, la multiomica a cella singola è pioniera nella valutazione di più modalità dalla stessa cella. Questo protocollo di isolamento a nucleo singolo è compatibile con la valutazione individuale e congiunta dei set di dati di espressione e cromatina. Abbiamo utilizzato pipeline standard stabilite da Stuart et al.23 (pacchetto Signac) per illustrare la qualità dei dati, mentre diversi metodi computazionali disponibili e alternativi possono essere facilmente adottati per le analisi a valle23,39,40,41.
Nel complesso, la multiomica a singolo nucleo consente lo studio di tessuti epatici di primati bio-archiviati, FF, umani e non umani utilizzando una quantità molto piccola di materiale campione di partenza implementando il protocollo di estrazione del nucleo qui presentato. Questo strumento inestimabile consentirà ai biologi del fegato di interrogare sia l’espressione genica che l’accessibilità della cromatina nel contesto di varie patologie epatiche. Inoltre, vari livelli di ploidia degli epatociti e il conseguente aggiustamento dell’espressione genica dipendente dalla loro posizione nel lobulo epatico potrebbero rivelare il loro ruolo nelle patologie epatiche. Pertanto, prevediamo che lo studio dell’eterogeneità cellulare fornirà nuove opportunità per lo sviluppo della medicina di precisione e interventi mirati contro malattie come HCC e NAFLD.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dall’Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) e dall’Institute of Computational Biology (C. T.-L.). Questa ricerca è stata supportata anche da AMED con il numero di sovvenzione JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Ringraziamo il supporto di Core Genomics presso HMGU (I. de la Rosa) e Bioinformatics (T. Walzthoeni), in particolare Xavier Pastor per la formazione e l’orientamento. Ringraziamo A. Feuchtinger, U. Buchholz, J. Bushe e tutti gli altri membri dello staff della struttura principale HMGU Pathology and Tissue Analytic per il loro supporto tecnico e scientifico, nonché J. Zorn, R. Erdelen, D. Würzinger, membri dello staff di E-Streifen, nonché la struttura principale di Laboratory Animal Services per il loro continuo supporto e discussione scientifica. Siamo grati alla Core Facility Cell Analysis di TranslaTUM (R. Mishra) e a Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Ringraziamo il Dr. I Deligiannis per il suo supporto tecnico. Il Dr. M. Hartman, il Dr. A. Schröder e la Sig.ra A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) sono stati fondamentali per il loro supporto legale, gestionale e amministrativo.
10% Tween 20 – 5 mL | Bio-Rad | 1662404 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
Adhesive PCR film | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | |
Cell Sorter | For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. | ||
Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000619 | Use chilled at 4 °C |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions | 10X Genomics | 1000269 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions | 10X Genomics | 1000285 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution | Sigma Aldrich | 646563 | Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration. |
DNA AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 10223471 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 16628742 | |
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 16638742 | |
Elution Buffer (EB) – 250 mL | Qiagen | 19086 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 13527550 | |
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock | Thermo Fisher Scientific | 13518470 | |
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10517694 | |
Filters 50 µm, sterile | SYSMEX PARTEC – CELLTRICS | 04-004-2327 | Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3905 | |
Herenz Heinz ABS Forceps | Thermo Fisher Scientific | 1131884 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Invitrogen | H3570 | Light-sensitive |
Imaging Flow Cytometer | For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream | ||
Invitrogen TE Buffer – 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 11568846 | |
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
MgCl2 (1 M), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips | Thermo Fisher Scientific | 10209104 | |
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips | Thermo Fisher Scientific | 10733087 | |
Mörser 2 mL DOUNCE | Wagner & Munz GmbH | 9651632 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 | Benchmark Scientific | C1012 | Or any other strip and tube mini centrifuge |
Neubauer Hemocytometer | OMNILAB LABORZENTRUM | 5435293 | Visualize and count nuclei under microscope |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma Aldrich | D1556 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O | Mettler Toledo | 30389218 | |
Pistill "A" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651621 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Pistill "B" 2 mL | Wagner & Munz GmbH | 9651627 | RNase zap and rinse with MillQ before use |
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | 10579691 | |
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 10634141 | |
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes | Thermo Fisher Scientific | 10100151 | |
Protector RNase inhibitor – 2,000 U | Sigma Aldrich | 3335399001 | Keep in -20 °C until use |
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | Keep in -20 °C until use |
Recombinant RNase Inhibitor | Clontech Takara | 2313B | Keep in -20 °C until use |
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | Wipe surfaces and pipettes before start of experiment |
SPRIselect – 60 mL | Beckman Coulter | B23318 | Aliquot and store in 4 °C |
Sucrose, 500 g | Sigma Aldrich | S0389-500G | Make a 1 M stock solution |
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels | Thermo Fisher Scientific | 11798343 | |
Tris-HCI (1M), pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100, 98%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 10671652 | Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light. |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 11538886 | |
Vortex- Mixer | VWR | 444-1372 | Or any other type of vortex |