Questo articolo descrive la misurazione semi-automatica delle ampiezze e delle latenze dei primi cinque picchi e depressioni nella forma d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale. Una routine aggiuntiva compila e annota i dati in un foglio di calcolo per l’analisi dello sperimentatore. Queste routine informatiche gratuite vengono eseguite utilizzando il pacchetto statistico open source R.
Molti rapporti negli ultimi 15 anni hanno valutato i cambiamenti nella forma d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) dopo insulti come l’esposizione al rumore. I cambiamenti comuni includono riduzioni dell’ampiezza del picco 1 e delle latenze relative dei picchi successivi, nonché un aumento del guadagno centrale, che si riflette in un aumento relativo delle ampiezze dei picchi successivi rispetto all’ampiezza del picco 1. Molti sperimentatori identificano visivamente i picchi e le depressioni per valutare le loro altezze e latenze relative, che è un processo laborioso quando le forme d’onda vengono raccolte in incrementi di 5 dB in tutta la gamma uditiva per ogni frequenza e condizione. Questo documento descrive routine libere che possono essere eseguite nella piattaforma open source R con l’interfaccia RStudio per semi-automatizzare le misurazioni dei picchi e delle depressioni delle forme d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR). Le routine identificano le ampiezze e le latenze di picchi e depressioni, le visualizzano su una forma d’onda generata per l’ispezione, raccolgono e annotano i risultati in un foglio di calcolo per l’analisi statistica e generano forme d’onda medie per le figure. Nei casi in cui il processo automatizzato identifichi erroneamente la forma d’onda ABR, esiste uno strumento aggiuntivo per assistere nella correzione. L’obiettivo è ridurre il tempo e gli sforzi necessari per analizzare la forma d’onda ABR in modo che più ricercatori includano queste analisi in futuro.
La risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) viene spesso utilizzata per determinare le soglie uditive nei soggetti animali e nei neonati umani. Poiché l’ABR è una registrazione elettroencefalogramma (EEG) delle prime risposte del sistema nervoso agli stimoli uditivi, trasporta informazioni aggiuntive che riflettono l’attivazione coordinata dei neuroni ganglio a spirale cocleare e l’elaborazione precoce del segnale nel tronco cerebrale uditivo, compresa l’elaborazione bilaterale1. Queste risposte possono essere influenzate da traumi da rumore. Ad esempio, l’esposizione al rumore che è sufficiente a indurre uno spostamento temporaneo della soglia nei topi può anche ridurre in modo permanente l’ampiezza del picco ABR 12. Inoltre, tale trauma può ridurre le latenze interpeak e aumentare le ampiezze relative dei picchi successivi3, probabilmente a causa di una perdita della regolazione inibitoria4. Oltre a questi risultati, specifiche mutazioni genetiche hanno dimostrato di alterare la forma d’onda ABR in assenza di trauma 5,6,7. Pertanto, l’analisi di routine delle forme d’onda ABR può fornire informazioni sul sistema uditivo nei modelli sperimentali.
C’è stato anche interesse nell’uso delle forme d’onda ABR come strumento diagnostico per i pazienti. Precedenti studi hanno valutato se il picco ABR 1 è ridotto nei pazienti umani dopo esposizione al rumore o nei pazienti con acufene 8,9. In particolare, è stato riportato che gli attacchi di emicrania aumentano temporaneamente le latenze interpeak per diverse settimane, dopo di che la forma d’onda ABR ritorna normale negli individui affetti10. È stato riportato che COVID-19 guida alterazioni a lungo termine nelle latenze ABR interpeak 11,12, sebbene un altro studio abbia riportato risultati diversi13. La perdita dell’udito è spesso co-morbida con la demenza nell’invecchiamento e gli individui con maggiore perdita dell’udito tendono a sperimentare la demenza che avanza più rapidamente14. I ricercatori hanno studiato i cambiamenti della forma d’onda ABR nelle malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson (rivisto in Jafari et al.15) e il morbo di Alzheimer (rivisto in Swords et al.16), così come nel normale invecchiamento 17. Man mano che sempre più ricercatori e medici studiano i deficit sensoriali come biomarcatori per le malattie comuni nell’invecchiamento, tecniche come l’ABR possono diventare di routine nell’assistenza sanitaria.
Un esame delle sezioni dei metodi in letteratura rivela che i laboratori spesso scrivono script personalizzati in MatLab per analizzare le forme d’onda ABR. La piattaforma ABR realizzata da Intelligent Hearing Systems ha una funzione per l’analisi delle forme d’onda, ma richiede che un operatore selezioni manualmente i picchi e le depressioni. Qui, abbiamo scritto routine di analisi semi-automatiche per l’ambiente statistico open source e liberamente disponibile R e l’interfaccia RStudio. Questo rapporto confronta i dati ottenuti utilizzando le nostre routine con i dati ottenuti facendo identificare manualmente i picchi e le depressioni da uno sperimentatore e mostra che i dati dei due metodi sono fortemente correlati. È importante sottolineare che le routine incorporano una funzione di accecamento, in cui i metadati per gli esempi vengono inseriti in un file separato che non viene incorporato fino alla fine. Queste funzioni hanno semplificato l’analisi delle forme d’onda per il nostro laboratorio.
Il protocollo descritto in questa pubblicazione dovrebbe aiutare a semplificare l’acquisizione dei dati che descrivono i rapporti di ampiezza della tensione e gli intervalli di latenza per ABR a clic e pip di tono. Utilizzando singoli comandi in RStudio, uno sperimentatore può estrarre, compilare e visualizzare queste informazioni in un unico documento per l’analisi statistica. Rendendo questa analisi di routine, speriamo che il campo scopra nuovi modi in cui l’ABR può essere alterato nello sviluppo, nell’invecchiamento o per insulto in diverse specie. Tali informazioni potrebbero essere preziose per identificare importanti meccanismi simili alla sinaptopatia da rumore2. I giovani topi utilizzati per questo esperimento hanno avuto risposte molto variabili, probabilmente perché il tronco cerebrale uditivo sta ancora maturando a questa etàdi 20 anni. Tuttavia, i due metodi di quantificazione hanno mostrato correlazioni molto forti (Figura 2).
Lo script utilizza un file chiamato “Time.csv” per impostare intervalli all’interno dei dati per l’identificazione dei picchi. In breve, un’ampiezza di tensione massima che si verifica in un intervallo di tempo specificato è etichettata come “picco 1”, una minima tensione che si verifica nell’intervallo successivo è etichettata “depressione 1” e così via. Abbiamo scelto gli intervalli per comprendere le latenze delle risposte pip sia click che tone per topi CBA / CaJ di età compresa tra 1 mese e 12 mesi utilizzando frequenze che vanno da 8 kHz a 32 kHz. Abbiamo utilizzato con successo lo strumento per misurare anche le risposte dei pip nei tono. Anche altre specie, compresi gli esseri umani, hanno risposte ABR all’interno di finestre simili e prevediamo che questo strumento possa essere utilizzato anche per i dati di altre specie. Raccomandiamo di utilizzare il nuovo metodo ABR parallelo per gli esseri umani21, che produce forme d’onda eccellenti. La limitazione dell’intervallo di tempo limita l’uso di questo strumento alla valutazione delle risposte ABR immediate. Notiamo tuttavia che i dati di intervallo in questo file potrebbero essere modificati dagli utenti per automatizzare le misurazioni delle risposte ABR al parlato o dei potenziali correlati agli eventi (ERP) che si verificano tipicamente in momenti diversi in risposta al suono.
Vale la pena evidenziare alcune caratteristiche del trattamento statistico di questi dati. Per quanto ne sappiamo, il campo non ha un trattamento standardizzato per distinguere le progressioni di ampiezza. I primi studi hanno utilizzato ANOVA22,23. I dati della serie di clic qui (Figura 2) erano non parametrici, portando all’uso del test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis. Analogamente ad ANOVA, il test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis valuta le differenze nei valori ottenuti a un dato livello di stimolo; cioè, confronta le linee ottenute sul grafico. Tuttavia, sono possibili anche altri trattamenti. Biologicamente, le progressioni di ampiezza riflettono il reclutamento aggiuntivo di neuroni a soglia più alta all’aumentare del livello di stimolo. Ciò suggerisce che l’area sotto la curva, che rappresenta gli integrali delle linee, potrebbe essere la misura più rilevante. Le equazioni di stima generalizzate (GEE) possono essere utilizzate per modellare i singoli dati per un’analisi integrale, come in Patel et al.5. In particolare, l’analisi GEE può prendere in considerazione la progettazione di misure ripetute di questi esperimenti. Man mano che sempre più ricercatori discutono i metodi di analisi dei dati, prevediamo l’emergere di un consenso sulle migliori pratiche.
In conclusione, questo documento presenta strumenti gratuiti e facili da usare per misurare, compilare e visualizzare le forme d’onda ABR. Questi strumenti possono essere utilizzati dagli studenti alle prime armi di RStudio seguendo questo protocollo e incorporano un passaggio accecante per migliorare il rigore e la riproducibilità. Prevediamo che l’analisi di routine della forma d’onda ABR consentirà la scoperta di insulti, varianti genetiche e altri trattamenti che possono influenzare la funzione uditiva.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da due sovvenzioni del NIDCD a PW: R01 DC018660 e un premio amministrativo supplementare, R01 DC014261-05S1.
C57BL/6J mice | Jackson Labs | 664 | |
CBA/CaJ mice | Jackson Labs | 654 | |
E-series PC | Dell | n/a (this equipment was discontinued) | This runs the IHS system. |
Mini-anechoic chamber | Industrial Acoustics Company | Special order number 104306 | This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals. |
Optiplex 7040 | Dell | i5-6500 | Rstudio may also be run on a Mac or Linux system. |
Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | n/a (this equipment was discontinued) | Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files. |