Biodosage de létalité à l’aide d’Artemia salina L.
概要
Ce travail vise à évaluer et à examiner la procédure d’essai biologique de létalité d’Artemia salina , également identifiée comme test de létalité des artémias. Cette méthode simple et peu coûteuse donne des informations sur la toxicité générale (considérée comme une évaluation préliminaire de la toxicité) des échantillons, à savoir les produits naturels.
Abstract
Les produits naturels sont utilisés depuis l’Antiquité pour produire des médicaments. De nos jours, il existe de nombreux médicaments chimiothérapeutiques obtenus à partir de sources naturelles et utilisés contre une pléthore de maladies. Malheureusement, la plupart de ces composés présentent souvent une toxicité systémique et des effets indésirables. Afin de mieux évaluer la tolérabilité de certains échantillons potentiellement bioactifs, la crevette salée (Artemia salina) est généralement utilisée comme modèle dans les études de létalité. Le test A. salina est basé sur la capacité des composés bioactifs étudiés à tuer les microcrustacés au stade larvaire (nauplii). Cette méthode représente un point de départ pratique pour les études de cytotoxicité, ainsi que pour le dépistage général de la toxicité des produits synthétiques, semi-synthétiques et naturels. Il peut être considéré comme un test simple, rapide et peu coûteux, comparé à de nombreux autres tests (cellules in vitro ou souches de levure, poisson zèbre, rongeurs) généralement adapté aux fins susmentionnées; De plus, il peut être facilement effectué même sans aucune formation spécifique. Dans l’ensemble, le dosage d’A. salina représente un outil utile pour l’évaluation préliminaire de la toxicité de composés sélectionnés et le fractionnement bioguidé d’extraits de produits naturels.
Introduction
Les produits naturels issus de plantes, d’animaux ou de micro-organismes ont été un domaine d’intérêt croissant au fil des ans dans le développement de nouvelles molécules bioactives en raison de leur gamme variée d’activités biologiques et pharmacologiques1. Cependant, les effets secondaires associés, la résistance aux médicaments ou la spécificité insuffisante des agents, en particulier lorsqu’ils sont utilisés comme médicaments anticancéreux, représentent les principaux facteurs pouvant conduire à un traitement inefficace 1,2.
Au cours des dernières décennies, plusieurs agents cytotoxiques d’origine végétale ont été découverts, certains d’entre eux utilisés comme agents anticancéreux 1,2,3. Dans ce contexte, le paclitaxel est considéré comme l’un des médicaments chimiothérapeutiques d’origine naturelle les plus connus et les plus actifs 3,4. Actuellement, on estime que plus de 35% de tous les médicaments sur le marché sont dérivés ou inspirés de produits naturels5. La toxicité potentiellement élevée de ces composés doit être prise en compte pendant toutes les phases de l’étude, car différents types de contaminants ou même des composants métaboliques de la plante elle-même peuvent avoir des effets toxiques. Pour cette raison, des profils pharmacologiques et toxicologiques devraient être établis au cours de la phase préliminaire, afin d’évaluer l’activité biologique et la sécurité de nouveaux traitements potentiels à base de plantes. Pour évaluer la toxicité de nouveaux échantillons bioactifs, les animaux invertébrés peuvent être considérés comme les meilleurs modèles à étudier. Ils exigent des exigences éthiques minimales et permettent des essais in vitro préliminaires, afin de prioriser les produits les plus prometteurs pour la prochaine série d’essais chez les vertébrés 1,6.
Communément appelée artémia, A. salina est un petit invertébré halophile appartenant au genre Artemia (famille Artemiidae, ordre Anostraca, sous-embranchement Crustacea; Graphique 1). Dans les écosystèmes salins marins et aquatiques, les artémias jouent un rôle nutritionnel important car elles se nourrissent de microalgues et sont des constituants du zooplancton utilisé pour nourrir les poissons. De plus, leurs larves (connues sous le nom de nauplii) sont largement utilisées dans l’évaluation de la toxicité générale lors des études préliminaires 1,3,7.
Les espèces du genre Artemia sont largement utilisées dans les études de létalité et constituent également un point de départ pratique pour les évaluations de toxicité, en suivant la toxicité de composés potentiellement bioactifs en fonction de leur capacité à tuer les nauplii cultivés en laboratoire 1,8. Pour cette raison, l’utilisation d’A. salina a gagné en attrait dans les études de toxicité générale, car il s’agit d’une méthode très efficace et facile à utiliser, par rapport à d’autres tests sur des modèles animaux9.
En raison de leur anatomie simple, de leur petite taille et de leur cycle de vie court, un grand nombre d’invertébrés peuvent être étudiés en une seule expérience. En tant que tels, ils combinent l’agrément génétique et la compatibilité à faible coût avec des criblages à grande échelle1. Dans ce contexte, l’utilisation de l’artémia dans un essai de toxicité générale présente plusieurs avantages, tels qu’une croissance rapide (28-72 h sont nécessaires de l’éclosion aux premiers résultats), la rentabilité et la longue durée de conservation des œufs commerciaux, qui peuvent être utilisés toute l’année 3,10. D’autre part, puisque les invertébrés ont un système organique primitif et n’ont pas de système immunitaire adaptatif, ils ne représentent pas un modèle parfait et fiable pour les cellules humaines1.
Cependant, il fournit une méthode d’évaluation préliminaire de la toxicité générale des échantillons sélectionnés. Comme il est largement utilisé comme test de létalité, il peut fournir des indications provisoires sur les effets toxiques des agents anticancéreux potentiels. Il est également souvent utilisé pour obtenir des retours sur la toxicité générale des composés dotés de toute autre activité biologique pour laquelle il est essentiel de montrer le taux de mortalité le plus bas possible parmi les crevettes Artemia .
Dans une étude en cours de notre groupe, différents extraits d’espèces de Plectranthus ont montré des activités antioxydantes et antimicrobiennes (résultats non publiés). En parallèle, des composés isolés ont été obtenus par purification des extraits et ont ensuite été modifiés chimiquement. Les extraits, les composés purs et les dérivés semi-synthétiques ont ensuite été testés en termes de toxicité générale. Dans ce contexte, le présent travail vise à donner un aperçu de l’utilisation du bioessai de létalité Artemia pour l’évaluation de la toxicité générale et de l’activité cytotoxique potentielle d’extraits bioactifs et de composés isolés de différentes plantes du genre Plectranthus11.
Figure 1 : Artemia salina au microscope. Nauplies nouvellement éclos d’A. salina vus au microscope (grossissement 12x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des dernières années, la communauté scientifique a porté une attention accrue aux modèles alternatifs pour les examens de toxicité21. Outre le bioessai de létalité d’A. salina, d’autres méthodologies sont généralement utilisées pour évaluer la tolérabilité des échantillons et comprennent des essais biologiques sur les vertébrés (tels que les rongeurs), les invertébrés (tels que le poisson zèbre), les méthodes in vitro utilisant des souches ou de…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En mémoire du professeur Amilcar Roberto.
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) dans le cadre des projets UIDB/04567/2020 et UIDP/04567/2020 attribués au CBIOS et à la bourse de doctorat SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
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