Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.
Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT), das PhotoACT genannt wird. Das Gerät wurde mit einem Satz herkömmlicher programmierbarer Leuchtdioden (LEDs), einem LCD-Modul (Liquid Crystal Display) und einem Lichtsensor gebaut, der an eine kommerzielle Mikrocontrollerplatine angeschlossen ist. Die kastenbasierte Struktur des Prototyps wurde mit mitteldichten Faserplatten (MDFs) hergestellt. Das interne Kompartiment kann gleichzeitig vier Zellkultur-Multiwell-Mikroplatten zuordnen.
Als Proof of Concept untersuchten wir die zytotoxische Wirkung des Photosensibilisators (PS) Verteporfin gegen die HeLa-Zelllinie in zweidimensionaler (2D) Kultur. HeLa-Zellen wurden 24 h lang mit steigenden Konzentrationen von Verteporfin behandelt. Das arzneimittelhaltige Überstandsmedium wurde verworfen, die adhärenten Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und medikamentenfreies Medium hinzugefügt. In dieser Studie wurde die Wirkung von Verteporfin auf Zellen entweder ohne Lichtexposition oder nach 1-stündiger Lichtexposition anhand von Rot-Grün-Blau (RGB) Werten von 255, 255 und 255 (durchschnittliche Fluenz von 49,1 ± 0,6 J/cm2) untersucht. Nach 24 h wurde die Zelllebensfähigkeit mit dem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay beurteilt.
Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die Exposition von mit Verteporfin behandelten Zellen gegenüber dem Licht des Geräts die zytotoxische Wirkung des Arzneimittels über einen Mechanismus verstärkt, der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wird. Darüber hinaus wurde die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps validiert, indem die Ergebnisse mit einem kommerziellen PDT-Gerät verglichen wurden. Somit stellt dieser LED-basierte photodynamische Therapieprototyp eine gute Alternative für in vitro Studien der PDT dar.
Unter den tödlichsten nichtübertragbaren Krankheiten ist Krebs eine weltweit häufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle. Im Jahr 2020 entfielen fast 10 Millionen Todesfälle, was etwa einem von sechs Todesfällen weltweit entspricht1. Darüber hinaus stellt das Phänomen der Multidrug-Resistenz (MDR) eine enorme Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, da zugelassene chemotherapeutische Protokolle für diesen klinischen Zustand keine Remissionsstadien erreichen2. Krebszellen können durch mehrere Mechanismen eine Resistenz gegen Chemotherapie entwickeln; Die Überexpression einiger ATP-bindender Kassettentransporter (ABC) – ATP-abhängige Effluxpumpen – gilt jedoch als Hauptursache für die MDR-Entwicklung innerhalb einer Tumormikroumgebung3. Neben der MDR verstärken andere Krebskomplikationen wie Rezidive und Metastasen die dringende Notwendigkeit, therapeutische Ansätze zur Bewältigung dieser onkologischen Herausforderung zu entwickeln und zu verbessern.
Die kurative Nutzung von Licht wird seit Jahrhundertenpraktiziert 4, und die photodynamische Therapie (PDT) stellt einen klinisch anerkannten Therapieansatz für solide Tumore dar. Die PDT kombiniert die Verabreichung eines Photosensibilisators (PS), gefolgt von Lichtbestrahlung, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, um selektive Zytotoxizität in Tumorzellen auszuüben. Dieser therapeutische Ansatz ist herkömmlichen Methoden wie Operation, Bestrahlung und Chemotherapie überlegen5; Es handelt sich um eine minimalinvasive Technik, die eine geringere Zytotoxizität im Bindegewebe aufweist6. Die Lichtapplikation und die PS-Akkumulation direkt im Tumor oder seiner Mikroumgebung gewährleisten ein präzises Targeting und folglich geringe, unerwünschte systemische Nebenwirkungen7 und die Möglichkeit einer wiederholten Behandlung an derselben Stelle. Darüber hinaus sind die Kosten niedriger als bei anderen Ansätzen. Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften kann die PDT als geeignete Option sowohl für die einzelne, insbesondere bei inoperablen Tumoren, als auch für die adjuvante Krebsbehandlung7 angesehen werden und stellt eine Alternative für MDR im Zusammenhang mit der Chemotherapiedar 8,9.
Der erste Bericht, der eine hohe objektive Ansprechrate unter Verwendung der PDT zeigte, wurde 1975 in einem Maus- und Rattenmodell10 beschrieben. Seitdem wurden Studien mit PDT mit positiven Ergebnissen7 sowohl in vivo als auch in vitro mit menschlichen Tumorzelllinien で 2D-Zellkulturdurchgeführt 11,12. Unter Berücksichtigung der breiten Anwendbarkeit klinisch zugelassener PS, unabhängig von ihren spezifischen Akkumulationswegen und Wellenlängenbereichen der Absorptionspeaks, ist der allgemeine Prozess wie folgt: (i) PS-Aufnahme, (ii) Spitzenwert der PS-Konzentration am Tumor oder seiner Mikroumgebung, (iii) Lichtanwendung, (iv) PS-Licht-Wechselwirkung, (v) Übertragung von PS-angeregter Energie entweder auf Gewebesubstrat oder umgebende Sauerstoffmoleküle, (vi) ROS-Produktion mit Singulett-Sauerstoff oder Superoxid-Anion, (vii) Tumorzelltod durch im Wesentlichen Nekrose oder Apoptose (direkter Tod), Autophagie (zytoprotektiver Mechanismus), Gewebeischämie (Gefäßschäden), Immunmodulation oder eine Überlappung dieser Mechanismen7. In diesem letzten Stadium hängt die Aktivierung eines spezifischen Zelltodwegs von vielen Faktoren ab, wie Zelleigenschaften, experimentellem Design und vor allem PS-intrazellulärer Lokalisation und PDT-bedingten gezielten Schäden13.
Verteporfin ist ein PS der zweiten Generation, das von Zulassungsbehörden für den klinischen Einsatz in Norwegen und China zur Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration7 zugelassen wurde. Nach Dosisabgabe wurde berichtet, dass sich dieses Prodrug teilweise in Mitochondrienanreichert 14 und zelluläre Proteintyrosinphosphorylierung und DNA-Fragmentierung induziert, was zu einer Tumorzellapoptoseführt 15,16. Nach 24-stündiger Inkubation zur Verteporfin-Internalisierung wird ein PDT-Protokoll unter Verwendung eines Wellenlängenaufbaus von 690 nm empfohlen, um eine effektive elektromagnetische Strahlungsübertragung auf benachbarte Moleküle 7,17 zu erreichen.
Was die Lichtquelle für PDT betrifft, so sind die klassischen Diodenlasersysteme in der Regel teuer, technisch kompliziert, überdimensioniert und daher nicht portabel18,19. Aufgrund seines Single-Wellenlängen-Profils, das auch in LED-basierten PDT-Geräten beobachtet werden kann, macht die Nachfrage nach unabhängigen Einheiten für jede Photosensibilisator-Anwendung den Einsatz von Diodenlasersystemen noch komplexer und wirtschaftlich nicht realisierbar20,21. Daher gilt die Verwendung von LED-Maschinen als die vielversprechendste Alternative, um nicht nur Kosten 22 und Wartungsprobleme zu lösen, sondern auch eine hohe Leistung und weniger schädliche23 und eine breitere Beleuchtungsfähigkeit24,25,26,27 bereitzustellen.
Trotz des potenziellen Beitrags, den LED-basierte Geräte zu PDT-Experimenten leisten können28, weisen die meisten kommerziellen Optionen immer noch Nachteile auf, wie mangelnde Portabilität, hohe Kosten und komplexe Bauprojekte und Betrieb29. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für In-vitro-PDT-Assays anzubieten. Dieses Dokument beschreibt PhotoACT, ein selbst gebautes LED-basiertes PDT-Gerät, das kostengünstig, benutzerfreundlich und tragbar ist. Als Machbarkeitsnachweis wird gezeigt, dass dieses Gerät die Zytotoxizität von Verteporfin in einem 2D-Zellkulturmodell verbessert und daher als Forschungswerkzeug in PDT-Experimenten verwendet werden kann.
Das endgültige PhotoACT-Gerät war bequem mit kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Komponenten zu Gesamtkosten von weniger als 50 US-Dollar zu konstruieren. Weitere Vorteile sind ein geringer Wartungsaufwand, die Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, ein geringes Gewicht (2 kg)/Größe (44 cm3), das Portabilität, genaue und reproduzierbare Bestrahlung (Daten nicht gezeigt) ermöglicht, und eine benutzerfreundliche u…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Arthur Henrique Gomes de Oliveira und Lucas Julian Cruz Gomes für die Unterstützung bei den Dreharbeiten. Dieses Projekt wurde vom brasilianischen Forschungsrat (CNPq, Förderkennzeichen 400953/2016-1-404286/2021-6) und der Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) unterstützt. Diese Studie wurde auch teilweise von Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 finanziert.
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
3D printer | Flashforge | Finder model | |
96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
Arduino | |||
Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
Buttons | |||
Buzzer | |||
Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
CO2 Incubator | |||
Controller board | ESP32 | ||
Design Software | Trimble | SketchUp | |
DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
LCD display | |||
LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
Potentiometers | |||
Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |