מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .
במהלך מיוזה, כרומוזומים הומולוגיים חייבים לזהות זה את זה ולהיצמד זה לזה כדי לאפשר הפרדה נכונה שלהם. אחד מאירועי המפתח שמבטיחים את האינטראקציה של כרומוזומים הומולוגיים הוא הרכבת הקומפלקס הסינפטונמלי (SC) בפרופאזה מיוטית I. אף על פי שאין כמעט הומולוגיה של רצף בין רכיבי חלבונים בתוך ה-SC בין מינים שונים, המבנה הכללי של ה-SC נשמר מאוד במהלך האבולוציה. במיקרוגרפים של אלקטרונים, ה-SC מופיע כמבנה משולש, דמוי סולם, המורכב מיסודות או צירים רוחביים, חוטים רוחביים ויסוד מרכזי.
עם זאת, זיהוי מדויק של לוקליזציה של רכיבים בודדים בתוך המתחם על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לקבוע את המבנה המולקולרי של SC נותר מאתגר. לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת זיהוי של רכיבי חלבון בודדים בתוך המכלול. עם זאת, מכיוון שרוחב ה-SC הוא ~100 ננומטר בלבד, לא ניתן לפתור את תת-המבנה שלו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית מוגבלת עקיפה. לפיכך, קביעת הארכיטקטורה המולקולרית של ה-SC דורשת טכניקות של מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה במיוחד, כגון מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מגורה (STED) או מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת (SMLM).
כדי לשמור על המבנה והאינטראקציות של רכיבים בודדים בתוך ה- SC, חשוב להתבונן במכלול בסביבה הקרובה לסביבה הטבעית שלה בתאי הנבט. לכן, אנו מדגימים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה והדמיה המאפשר לחקור את תת-המבנה של ה-SC ברקמת נבט של Caenorhabditis elegans שלמה, עם SMLM ומיקרוסקופיית STED. קיבוע ישיר של הרקמה לכיסוי מפחית את תנועת הדגימות במהלך ההדמיה וממזער סטיות בדגימה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה הדרושה כדי לדמיין את תת-המבנה של ה- SC בהקשר הביולוגי שלו.
הפחתת מספר הכרומוזומים בחצי במהלך המיוזה היא המפתח ליצירת צאצאים בריאים באורגניזמים המתרבים מינית. כדי להשיג הפחתה זו במספר הכרומוזומים, כרומוזומים הומולוגיים חייבים להזדווג ולהפריד במהלך מיוזה I. כדי להבטיח הפרדה מדויקת של כרומוזומים הומולוגיים, תאי הנבט עוברים פרופאזה I מורחבת, שבמהלכה כרומוזומים הומולוגיים מזווגים, סינפסה ומתאחדים מחדש כדי ליצור קשרים פיזיקליים בין הומולוגים1. ה- SC התגלה כמבנה המרכזי שהוא המפתח לוויסות ההתקדמות הנכונה באמצעות פרופאזה מיוטית2.
ה-SC הוא קומפלקס שהמבנה הכללי שלו נשמר מבחינה אבולוציונית, למרות שיש מעט הומולוגיה בין מרכיבי החלבון שלו. ה-SC זוהה לראשונה במיקרוגרפים של אלקטרונים כמבנה משולש, דמוי סולם, המורכב משני יסודות או צירים רוחביים, אזור מרכזי שנוצר על ידי חוטים רוחביים, ויסוד מרכזי 3,4. קביעת הארגון של רכיבים בודדים בתוך המתחם היא המפתח לקידום הבנתנו את תפקיד ה- SC במהלך פרופאזה מיוטית.
אורגניזם המודל C. elegans מתאים באופן אידיאלי לחקור את המבנה והתפקוד של SC מכיוון שהחיידקים שלו מכילים מספר רב של גרעינים מיוטיים עם SCs5 מורכבים במלואם. מחקרים גנטיים וביוכימיים גילו כי צירי הכרומוזומים נוצרים על ידי שלושה קומפלקסים שונים של קוהסין6,7 וארבעה חלבוני תחום HORMA הנקראים HTP-1/2/3 ו-HIM-3 7,8,9,10,11 ב-C. elegans. באזור המרכזי של ה-SC זוהו עד כה שישה חלבונים המכילים תחומים סליליים מפותלים 12,13,14,15,16,17. כדי לגשר על המרחק בין שני הצירים, SYP-1, -5 ו-6- מתעמעמים באופן ראש בראש (איור 1), בעוד ששלושה חלבונים נוספים מייצבים את האינטראקציה שלהם ביסוד המרכזי16,17,18,19.
קבלת תובנה מפורטת על הארגון של חלבונים אלה חיונית להבנת הפונקציות הרבות של SC במהלך מיוזה. מכיוון שרוחב האזור המרכזי של ה-SC הוא רק ~100 ננומטר, לא ניתן לפתור את תת-המבנה שלו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוגבלת עקיפה. עם זאת, הדמיה של רכיבים בתוך מבנה בגודל זה ניתנת להשגה בקלות על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. ואכן, מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), מיקרוסקופיית הרחבה 20, מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED) 21, ומיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולות בודדות (SMLM)22,23 התגלו ככלים חיוניים לחקר הארכיטקטורה המולקולרית של ה-SC על פני מינים 16,24,25,26,27,28,29, 30.
כדי להתגבר על מגבלת הרזולוציה, מיקרוסקופיית STED מסתמכת על כיסוי הנקודה המוגבלת בדיפרקציה של אור הפליטה עם קרן בצורת סופגנייה מלייזר STED, אשר תיאורטית מכווצת את פונקציית התפשטות הנקודות לממדים מולקולריים31,32. עם זאת, הרזולוציה הניתנת למעשה להשגה על ידי STED בתוך דגימות ביולוגיות נשארת בטווח של כמה עשרות ננומטרים ב– xy33.
רזולוציה גבוהה עוד יותר בדגימות ביולוגיות ניתן להשיג עם טכניקות SMLM. SMLM רותם את תכונות המצמוץ של פלואורופורים ספציפיים כדי לפתור אובייקטים ברמת תת-עקיפה על ידי הפרדת פלואורופורים חופפים מרחבית בזמן. לאחר מכן הדגימה מצולמת שוב ושוב כדי ללכוד תת-קבוצות שונות של פלואורופורים. המיקום של הפלואורופורים בתוך הדגימה נקבע לאחר מכן על ידי התאמת פונקציית התפשטות הנקודות (PSF) לאותות המתקבלים בכל התמונות, מה שיכול לפתור מבנים עד 15 ננומטר23,34.
יחד, התמונות המקומיות מקודדות את מיקומם של כל הפלואורופורים. הרזולוציה של SMLM נקבעת על ידי צפיפות הסימון והמאפיינים המצמוץ של הפלואורופור. על פי קריטריון ניקוויסט-שאנון, אי אפשר לפתור באופן אמין אובייקטים שהם פחות מפי שניים מהמרחק הממוצע בין תווית לתווית. לפיכך, יש צורך בצפיפות תיוג גבוהה להדמיה ברזולוציה גבוהה. עבור SC ב- C. elegans, ניתן להשיג צפיפות תיוג גבוהה על ידי שימוש בתגי אפיטופ המוצמדים לאתרים ספציפיים של חלבונים אנדוגניים באמצעות עריכת גנום. לאחר מכן ניתן להכתים את תגי האפיטופ בצפיפות גבוהה באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים בעלי זיקות גבוהות19,30. יחד עם זאת, המחזור של פלואורופורים בודדים חייב להיות קצר מספיק כדי להבטיח שפלואורופורים חופפים מרחבית לא יילכדו בו זמנית35.
בשל שתי דרישות אלה, פתרון המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים גדולים כגון SC דורש הדמיה של מספר גדול מספיק של תמונות, ולכן יכול לקחת כמה שעות. המלכודת של זמני הדמיה ארוכים היא שדגימות נוטות להיסחף עקב תנועה של השלב או זרמים קטנים בתוך מאגר הדגימה; אפילו תנועות קטנות בסדר גודל של 10 ננומטר מזיקות ברזולוציית NM ויש לתקן אותן. עם זאת, שיטות תיקון הסחף הנפוצות אינן חזקות מספיק כדי לכסות במדויק תמונות של שני ערוצים שצולמו ברצף36. זה בעייתי מכיוון ששאלות ביולוגיות מבקשות לעתים קרובות זיהוי מדויק ולוקליזציה של מטרות מרובות בתוך אותה דגימה. כדי לעקוף בעיות אלה, פותחו שיטות כגון הדמיה יחסותית. הדמיה רציומטרית מאפשרת הדמיה סימולטנית של פלואורופורים מרובים עם ספקטרום עירור ופליטה חופפים, עם הקצאה עוקבת של כל אות שזוהה לפלואורופור המתאים לו בהתבסס על יחס העוצמות בערוצים נפרדים ספקטרלית37,38.
בנוסף, לימוד הארגון של קומפלקסים מקרומולקולריים כגון SC דורש מידע תלת-ממדי (3D). כדי להשיג רזולוציית-על בשלושה ממדים (3D-SMLM), עדשה גלילית משולבת בנתיב האופטי של האור הנפלט המעוותת את צורת ה-PSF של פלואורופור בהתאם למרחקו ממישור המוקד. לפיכך, ניתן לבצע אקסטרפולציה של המיקום המדויק של פלואורופור במישור z על ידי ניתוח צורת אות הפליטה שלו35,39. שילוב ההתקדמות הזו ב-SMLM מאפשר הדמיה של הארגון התלת-ממדי של קומפלקסים מקרומולקולריים, כולל ה-SC.
הארגון דמוי הסולם של ה-SC, החיוני לרקומבינציה נכונה ולהפרדה של כרומוזומים הומולוגיים, נצפה לראשונה לפני כמעט 70 שנה במיקרוסקופיית אלקטרונים 3,4. בעוד שהארגון הכולל של ה- SC נפתר בקלות במיקרוסקופיית אלקטרונים, לוקליזציה של רכיבים בודדים בתוך קומפלקס זה דורשת גישה ממוקדת יותר. עם רוחבו של ~ 100 ננומטר בלבד, לא ניתן לפתור את תת-המבנה של ה- SC על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. עם זאת, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הפכה למניע מרכזי לתגליות חדשות על המבנה והתפקוד של הקומפלקס הסינפטונמלי 16,19,24,25,26,27,28,29,30. כדי להקל על מחקר זה, הדגמנו הליך הרכבה המאפשר ללמוד את הארכיטקטורה של SC בתוך C. elegans gonad רקמה עם SMLM ו STED מיקרוסקופיה.
שלב קריטי למיטוב הרזולוציה בהדמיית SMLM הוא קישור ישיר של רקמת הנבט לכיסוי מצופה פולי-L-ליזין (שלב 4). ההצמדה הקוולנטית של הרקמה לכיסוי חיונית כדי להפחית את התנועות בתוך הדגימה שיגרמו לסחף גדול ויהפכו את ההדמיה לאורך פרקי זמן ארוכים עבור SMLM לבלתי אפשרית. בנוסף, אפילו חיבור לא אופטימלי שמשאיר את הגרעינים המכילים SCs במרחק מהכיסוי מוביל לירידה משמעותית ברזולוציה הניתנת להשגה כתוצאה מסטיות כדוריות (איור 4). לחלופין, לחיבור הקוולנטי המשמש כאן, רקמת נבט מוכתמת יכולה גם להיות משותקת בין שני כיסויים אטומים בטיפה קטנה של מאגרהדמיה 19,30. עם זאת, שיטת אימוביליזציה זו מפחיתה מאוד את נפח מאגר ההדמיה בדגימה מ-1 מ”ל המשמש בפרוטוקול הממוטב כאן למספר μL בלבד, מה שיגרום להחמצת מאגר ההדמיה ויפחית מאוד את הזמן שבו ניתן לצלם את הדגימה 38,53,54.
זמני רכישה ארוכים הן עבור מיקרוסקופיית SMLM והן עבור מיקרוסקופיית STED מגבילים את השימוש בשיטות אלה להדמיה של דגימות קבועות כימית. כאן, קיבוע paraformaldehyde מבטיח כי המבנה של SC נשמר במהלך הכנת המדגם והדמיה. עם זאת, למרות אמצעי הזהירות שננקטו כאן כדי לדמות את ה-SC בתוך רקמה שלמה, המבנה המתקבל של ה-SC לאחר הקיבוע אינו בהכרח זהה למבנה במצבו הטבעי בתוך אורגניזם חי. יתר על כן, מכיוון שתמונה אחת של ה-SC הקבוע מייצגת “תמונת מצב” יחידה של המבנה הביולוגי, גישה זו נותרת עיוורת לדינמיקה של המבנה המקומי in vivo.
עם זאת, מידע על הדינמיקה והשונות של מבנים מקרומולקולריים יכול גם להתקבל על ידי רכישת לא רק אחד אלא רבים “תמונות”. בעוד שגישה זו יכולה לפתור שינויים במבנה של SC במהלך pachytene19, ישנם מספר גורמים המגבילים את מספר התמונות שניתן לרכוש מדגימה אחת שהוכנה באמצעות פרוטוקול זה. ראשית, כוחות הלייזר הגבוהים המשמשים במהלך רכישת התמונה מובילים להלבנה קבועה של הפלואורופורים ומונעים הדמיה של אזורי עניין סמוכים או מישורי z מרובים, ובכך מפחיתים משמעותית את מספר התמונות שניתן לרכוש מדגימה אחת. שנית, צפיפות הדגימה/רקמה על הכיסוי שהוכן בשיטה זו נמוכה, מה שמגביל משמעותית את מספר התמונות שניתן לרכוש מכיסוי יחיד. צפיפות הדגימה הנמוכה אוסרת גם על שימוש בצינורות אוטומטיים לרכישת תמונות שעזרו לשפוך אור על שאלות ביולוגיות אחרות 34,55,56,57,58,59. עם זאת, צפיפות המדגם יכולה להיות מוגברת מעט על ידי משתמש מנוסה.
הפרוטוקול המוצג כאן מותאם להשגת צפיפות תיוג גבוהה הנחוצה להשגת רזולוציה אופטימלית ב- SMLM35. בעוד שפרוטוקולים קודמים מצמידים את הרקמה באופן קוולנטי לכיסוי לפני חיסון16, פרוטוקול חדש זה מצליב את הרקמה לכיסוי רק לאחר שהדגימות הוכתמו בתמיסה. שינוי זה מאפשר לנוגדנים המשמשים להדבקה חיסונית לגשת באופן חופשי לרקמה מכל הצדדים, בעוד שהחיבור הקוולנטי של הרקמה לכיסוי עשוי להגביל את הגעת הנוגדנים לגרעינים הקרובים ביותר לכיסוי, ובכך להפחית את מידת התווית. יחד, השינויים המתוארים כאן משפרים את הרזולוציה מ-40-50 ננומטר (רזולוציית FRC)16 ל-30-40 ננומטר (פרוטוקול זה).
חשוב לציין כי בעוד שצפיפות תיוג גבוהה וריכוז גבוה של נוגדנים חיוניים ל-SMLM, מצאנו שתמונות מיקרוסקופיות STED טובות יותר מתקבלות באמצעות ריכוזי נוגדנים נמוכים יותר (שלב 3). ברזולוציה של עשרות ננומטרים, גודל המולקולות המשמשות לתיוג החלבון המעניין הופך לחשוב יותר ויותר. לכן השתמשנו בשברי F(ab’)2 שגודלם מחצית מגודלם של נוגדנים באורך מלא. השיפור בניגודיות המקומית עקב מקור אות קטן יותר, ולכן הרזולוציה שהושגה על ידי שינוי זה בהשוואה לשימוש בנוגדנים משניים באורך מלא, אפשרו את הרזולוציה של שני C-termini של SYP-5 באזור המרכז על ידי TauSTED, אשר אינם נפתרים על ידי STED קונבנציונאלי באמצעות נוגדנים באורך מלא (16 ונתונים לא מוצגים). אנו צופים כי פרוטוקול ממוטב זה להדמיית SCs ב-C. elegans germlines שלמים יקל על חקירת הקשר בין מבנה לתפקוד של ה-SC במהלך מיוזה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לג’ונאס ריס ולמעבדת ריס על שיתוף מאגרי הדמיה להדמיית SMLM. אנו מודים גם ליומי קים על זן C. elegans המשמש בפרוטוקול זה ולאבי פ. דרנבורג על הנוגדן נגד HTP-3. אנו מודים למרקו לאמפה וסטפן טרג’ונג ממתקן מיקרוסקופיית האור המתקדם ב- EMBL היידלברג על תמיכתם בשימוש במיקרוסקופ הקונפוקלי Olympus iXplore SPIN SR. עבודה זו נתמכה על ידי המעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית ו- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית – 452616889, SK). אנו מכירים את הגישה והשירותים הניתנים על ידי מרכז ההדמיה במעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית (EMBL IC), הנתמכים בנדיבות על ידי קרן Boehringer Ingelheim.
100x/1.5 oil objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | UPLAPO100XOHR |
2-mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070-10G | Dissolved in MilliQ water to 5 M solution, pH 8.7 adjusted with HCl. Aliquoted to a single-use volume, frozen, and kept at -80 °C. |
Additional 640 nm booster laser | Toptica | IBEAM-SMART-640-S-HP | |
AlexaFluor 594, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37572 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
AlexaFluor 647, NHS ester | ThermoFischer Scientific | A37573 | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
anti-HA | Thermo Fisher Scientific | 2-2.2.14 | Mouse monoclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
anti-HTP-3 | a gift from Abby F. Dernburg | MacQueen et al., 2005 | Chicken polyclonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Caenorhabditis elegans strain YKM349 | a gift from Yumi Kim | Hurlock et al., 2020 | syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II |
CF6680, NHS ester | Biotium | 92139 | Dissolved in DMSO to 1mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Circular cover glass 12 mm No. 1 | Menzel-Gläser; VWR | 631-0713 | |
Circular cover glass 24 mm No. 1.5 | Carl Roth | PK26.1 | |
Cylindrical lenses | Thorlabs | LJ1516RM-A, LK1002RM-A | |
Egg Buffer (10x) | Edgar 1995 | 250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4 | |
Ethanol (absolute for analysis) | Merck | 64-17-5 | |
F(ab’)2 fragment anti-chicken IgY | Jackson Immunoresearch | AB_2340347 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
F(ab’)2 fragment anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | AB_2340761 | Donkey polyclonal, 1:100 (SMLM), 1:1,000 (STED Microscopy) |
Fisherbrand Microscope slides T/F Ground 0.8-1.0 mm thick | Fisher scientific | 7107 | |
Gauge Worm Pick 30 diameter 0.254 mm – Iridium 10% | Kisker | 789265 | |
Glucose oxidase/Catalase enzyme mix (GlOX/Cat ) | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 20x, 1916 U/mL glucose oxidase (Sigma G7141), 42350 U/mL catalase (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glycerol, MilliQ water. Stored at -20 °C. |
Imaging buffer base | a gift from Jonas Ries | Hoess, Mund, Reitberger, & Ries, 2018 | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-Glucose. Aliquoted to a single-use volume (950 μL), frozen, and kept at -80 °C. |
Invitrogen ProLong Glass Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36982 | |
Leica Stellaris 8 STED FALCON | Leica | N/A | The microscope is equiped with the latest generation white light laser, a 775nm pulsed STED laser, the FALCON Fluorescence Lifetime IMaging module, HC PL APO CS2 100x/1.40 oil objective, and Leica HyD X detector. The system is capable of FLIM module enhanced Tau-STED which measures the specific fluorescence lifetime of a dye and is therefore capable of removing background signal based on differences in fluorescence lifetimes of the dyes, and dye conditions in the sample. Additionally, the resolution is increased by accounting for the variation of fluorescence lifetimes in different areas of the depletion donut. |
Longwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F47-702 | 700/100 nm bandpass |
Methanol (absolute for analysis) | Merck | 67-56-1 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich/Merck | S5761-500G | 100 mM NaHCO3, pH 8.3 |
Near-infrared fiber-coupled laser | Toptica | IBEAM-SMART-PT-CD | Custom Design, 808 nm – 75mW |
Objective lens piezo mount (PIFOC ) | Physik Instrumente | P-726.1.CD | 100 µm travel range |
Orca Fusion BT sCMOS camera | Hamamatsu | C15440-20UP | |
PCR tubes | Greiner Bio-One | 673283 | 0.2 mL |
Phosphate Saline Buffer (PBS 10x) | N/A | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
Pierce 16% formaldehyde (w/v), methanol free | ThermoFischer Scientific | 28906 | 16% formaldehyde is transferred from the original glass ampule into 1.5 mL tube and kept at room temperature. |
PlasmaPrep2 plasma cleaner | GaLa Instrumente GmbH | N/A | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich/Merck | P2636-25MG | 0.1% w/v solution was prepared in Milli-Q water, and stored in aliquots at -20 °C. |
Primary dichroic (illumination reflecting) | AHF Analysentechnik | F73-866S | quad bandpass @ 405, 488, 561, 640 |
Quadnotch filter | AHF Analysentechnik | F40-072 | 405/488/561/640 nm |
Quadrant photodiode (QPD) | Laser Components | SD197-23-21-041, LC301DQD-PV | |
Razor blades | Apollo Herkenrath Solinger | N/A | |
Refractive beam shaper | AdlOptica | PiShaper 6_6_VIS | |
Roche Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | 10x solution was prepared according to recommendation. Frozen aliquots were stored at -20 °C. |
Scalpel blade (Feather brand #11, No. 3) | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110911 | |
Scalpel removal box | Fisher scientific | 10002-50 | |
Secondary dichroic (emission reflecting) | AHF Analysentechnik | F38-785S | 750 nm longpass |
Shortpass filter | Semrock | BSP01-785R-25 | 750 nm |
Shortwave channel emission filter | AHF Analysentechnik | F37-677 | 676/37 nm bandpass |
Single molecule localization microscope | EMBL Imaging Centre | Diekmann et al., 2020 with modifications | The microscope provides widefield epi-illumination via a single-mode fiber-coupled laser engine, additional booster laser, and refractive beam shaper to provide a uniform illumination field (Stehr et al, 2019). Widefield images are captured on a sCMOS camera and appropriate relay optics for a system magnification of 61x and a pixel size of 106 nm. For ratiometric imaging of spectrally overlapping far-red dyes, an image splitter produces two spectrally distinct images on the camera (splitting dichroic: 665 nm long pass, shortwave channel emission filter: 676/37 nm bandpass, longwave emission filter: 700/100 nm bandpass. An additional 405/488/561/640 nm quadnotch filter and 750 nm shortpass filter are common to the two paths and provide additional laser blocking). A compound cylindrical lens provides the astigmatism required for 3D imaging. To maintain a fixed focus across acquisitions exceeding 2 hours in time (comprising 200 000 – 250 000 images), focus locking is achieved by total internal reflection of a near-infrared fiber-coupled laser from the coverslip and subsequent height sensitive detection on a quadrant photodiode (QPD). The QPD signal provided closed-loop control of the objective lens piezo mount. For access to this microscope, refer to https://www.embl.org/about/info/imaging-centre or contact ic-contact@embl.de |
Single-mode fiber-coupled multi-laser engine | Toptica | iCHROME MLE-LFA-HP | Provides widefield epi-illumination of 100 mW at 405, 488, 561, 640 nm |
Splitting dichroic | AHF Analysentechnik | F48-665SG | 665 nm long pass |
Square cover glass 22 x 22 mm No.1 | Menzel-Gläser; VWR | 630-2882 | |
STAR 635P, NHS ester | Abberior | ST635P-0002-1MG | Dissolved in DMSO to 1 mM solution, aliquoted to single use volume, frozen and kept at -80 °C |
Stereo microscope Stemi 305 Stand K LAB | Zeiss | N/A | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich/Merck | T1512-2G | 1% (w/v) solution was prepared in Milli-Q water. Frozen aliquots were stored at -20 °C. Thawed aliquot was kept at 4 °C and used for several months. |
TetraSpeck Microspheres | ThermoFischer Scientific | T7279 | 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red |
Tris Saline Buffer (TBS 10x) | N/A | 200 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich/Merck | P9416-50ML | Kept at room temperature in original packaging. |
WormStuff worm pick | Kisker | 789277 | |
XY microscope stage | Smaract | N/A | Custom Design |
Zeba Micro Spin Desalting Column | ThermoFischer Scientific | 89877 | 7K MWCO, 75 µL |