神経活動の異常に伴う精神神経疾患の病態解明を目指し、高い時空間分解能で神経活動を可視化・評価・操作できる2光子ホログラフィック顕微鏡を開発しました。
近年の光バイオイメージングやオプトジェネティクスの進歩により、生きた動物における細胞活動を含む生命現象の可視化と操作が可能になりました。神経科学の分野では、学習や記憶などの脳機能に関わる詳細な神経活動が明らかになり、この活動を人工的に操作して脳機能を発現させることも可能になりました。しかしながら、従来の2光子Ca2+ イメージングによる神経活動の評価は、時間分解能が低いという課題があった。また、従来の光遺伝学による光ファイバーを介した神経活動の操作は、同じ遺伝的背景を持つニューロンの活動を同時に制御することしかできず、個々のニューロンの活動を制御することは困難です。この問題を解決するために、我々は最近、オプトジェネティクスとフェムト秒赤外線レーザービームを修飾できるデジタルホログラフィック技術を組み合わせることにより、生物学的応用のための高時空間分解能の顕微鏡を開発しました。ここでは、サンプルの調製や2光子ホログラフィック顕微鏡の操作など、神経活動の可視化、評価、操作のためのプロトコルについて説明します(図1)。これらのプロトコルは、神経活動に関する正確な時空間情報を提供し、神経活動の異常につながる精神神経疾患の病態解明に役立つ可能性があります。
二光子Ca2+イメージングは、神経活動の評価に有用な技術です。正常な動物の行動や記憶に必要な神経活動だけでなく1,2だけでなく、神経精神疾患のマウスモデルで発生する異常な神経活動3,4を特定するためにも使用できます。この技術は、脳機能の神経基盤を解明するために使用されてきました。しかし、高解像度で高品質な画像を提供することはできますが、その時間分解能は電気生理学的方法1,3よりも低くなります。
オプトジェネティクスは、神経科学者が脳機能を理解する方法を革新するのに役立ちました5。技術的な限界を考えると、光遺伝学的研究の大部分は、低い空間分解能の活性化スキームを使用しており、それに応じて実行できる神経活動の操作の種類を制限しています。しかし、より細かい時空間スケールで神経活動を操作することは、神経計算と神経精神障害の病因をより完全に理解するのに役立つ可能性があります。フェムト秒近赤外線レーザービームを成形できる空間的に正確なホログラフィック技術は、この課題を克服することを約束し、以前は不可能だったいくつかの新しい実験クラスを開きます6,7。この技術により、神経科学者は、これまで手の届かない感覚、認知、行動の神経コードの基本的な側面と病理を明らかにすることができます。
ホログラフィック投影は、個々の細胞および機能ネットワークに選択的にアクセスするための所望の光パターンの生成を含む。in vivo実験では、生きている脳の標的細胞への最適な光透過率が必要です。赤外光は生体組織の奥深くまで浸透し、非線形2光子励起(2PE)8,9,10に使用できます。したがって、ホログラフィック投影と2PEを組み合わせた2光子ホログラフィック顕微鏡を使用して、神経活動を評価および操作して、in vivoの細胞および機能ネットワークを調べることができます。近年の2光子ホログラフィック顕微鏡の生物学的応用により、視覚野11,12、嗅球13、海馬14における学習に必要な神経活動や回路が解明されてきている。
世界中の多くの研究所が、ホログラフィック刺激システムを使用してエキサイティングな結果と改善を報告しています15、16、17、18、19、20、21、22、23。ここで説明するシステムでは、ホログラフィック刺激システムは、従来の顕微鏡のアドオンデバイスとして構築できます。位相のみの空間光変調器(SLM)は、平面波面を任意の形状に変調するための重要なデバイスであり、干渉効果を使用して焦点の強度と位置を制御します。図2は、ホログラフィック刺激とイメージング光路を示しています。第1の光路はポイントスキャンイメージングモード用で、スキャンヘッドと画像検出器で構成されています。第2の光路は、1040nmの波長を有するホログラフィック刺激用であり、SLM1からなる。第3の光路は波長920nmのホログラフィック照明用で、SLM2とイメージセンサーで構成されています。ホログラフィックイメージングモードは、サンプル内の複数のポイントを照らすことによって、複数の関心領域からの強度を記録することができます。このようにして、記録速度を毎秒数百フレームに上げることができる。ポイントスキャンイメージングまたはホログラフィック照明イメージングを実現するために、920nmレーザーは、3:7の固定比率のビームスプリッターによって2つのパスに分割されました。全ての光学素子は、600mm×600mmの寸法を有する光学ブレッドボード上に位置合わせされた。変調された光は顕微鏡体の側面にある光ポートから入り、点走査された撮像光は顕微鏡体の上部にあるスキャンヘッドを通って入射した。これらの光は対物レンズのすぐ上に統合され、サンプル面に焦点を作成しました。さらに、カスタムメイドのソフトウェアにより、通常のワークフローをシンプルで一貫性のあるものにすることができました。
この記事では、ホログラフィック刺激または照明を使用して神経活動を測定し、ニューロン間の機能的接続性を評価するための完全なプロトコルを紹介します。デモンストレーションのために、マウス脳の一次体性感覚皮質(S1HL)の後肢領域を対象とした脳手術と、2光子ホログラフィック顕微鏡を使用して神経活動を評価および操作する方法について説明します。実験手順は4つの部分に分かれています。まず、ヘッドプレートを歯科用セメントを用いてマウスの頭蓋骨に固定した。次に、jGCaMP8fまたはGCaMP6m-P2A-ChRmineを発現するウイルスベクターをS1HLに定位的に注入した。第三に、ホログラフィック刺激または照明システムを較正した。第四に、これら2つのタンパク質の術後の回復と発現後、 in vivo Ca2+ イメージングを実施し、2光子ホログラフィック顕微鏡でニューロン間の神経活動と機能的接続を評価しました。
脳機能を理解するためには、神経活動のダイナミクスを抽出し、脳機能の根底にある神経回路を正確に評価する必要があります。さらに、この神経回路がどのように変化しているかを明らかにすることは、精神神経疾患の病態解明に不可欠です。実際、アルツハイマー病4 や脆弱X症候群26 のマウスモデルや白質機能障害3のマウスでは神経活動が上昇することが知られている。さらに、炎症性疼痛のマウスモデルでは、神経活動とニューロン間の機能的接続性の同期の増加が症状24と関連している。2光子ホログラフィック顕微鏡は、神経回路を理解するために必要な個々のニューロンの活動とニューロン間の機能的接続を同時に観察することができます。口径数=1.1、波長1,040nmの25倍対物レンズを使用しました。理論上の点像分布関数は、横方向に0.5μm、軸方向に1.7μmの半値の全幅を持つガウス分布です。ただし、実際の開口数は1.1未満であり、蛍光ビーズで測定されたスポットサイズは横方向に1.2μm、軸方向に8.3μmです。ニューロンの直径が約15μmで、キャリブレーション誤差が3μm以内であることを考えると、ターゲティングは一般的に良好です。しかしながら、軸方向の細胞は、より長いスポットサイズ6の影響を受け得る。ここでは、ウイルス注入、手術、ホログラフィック刺激または照明システムのキャリブレーション、および顕微鏡システムを使用して生きたマウスの神経活動を評価および操作するためのイメージングプロトコルについて説明しました。
ヘッドプレートの移植やウイルス注入から、ホログラフィック顕微鏡を使用したin vivo Ca2+イメージングのデータ収集まで、すべての実験手順を完了するには2〜4週間かかります。このプロセスは複雑で面倒であり、実験の最終的な成功は、術後の炎症の影響を受ける頭蓋窓の状態、Ca2+インジケーターとオプシンの適切な選択、取得した画像のモーションアーチファクトを修正できるかどうかなど、複数の要因に依存します。特に、結果を成功させるには2つのステップが重要です。1つ目は、ヘッドプレートの固定と手術に関するものです。ヘッドプレートを歯科用セメントでマウスヘッドにしっかりと固定することが重要です。さらに、手術中は冷たいACSFを使用して骨片や凝固した血液を繰り返し洗浄することが重要です。この手順を順守すると炎症が軽減されるため、脳の免疫系に関与する細胞であるミクログリアのダイナミクスを、それらのプロセスや棘、またはニューロンの微細構造を活性化することなく観察することに成功しました27,28。第2の問題は、神経活動の評価と操作です。我々は、1つのニューロンでCa2+指示薬とオプシンを同時に発現させるためにAAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1を選択しました。これは、異なるAAVタイプの1つのニューロンを効率的に感染させることが難しいためです。この選択のもう一つの理由は、ChRmineが2光子レーザー12を用いて1,040nmで神経活動を効率的に活性化できることである。最近、クライオ電子顕微鏡で得られた構造情報に基づいて構造を変異させることで、ChRmineの機能が向上することが報告されており29、神経科学分野の標的機能解析に有用であると考えられています。これらの問題を踏まえると、ホログラフィック顕微鏡を用いて神経活動を読み取ったり情報を書き込んだりする際に、神経細胞を評価・操作するための効果的な方法を共有する必要があります。
近年のイメージングやオプトジェネティクスの進歩により、学習や記憶などの脳機能に関わる詳細な神経活動が明らかになり、この神経活動を人工的に操作して脳機能を発現させることが可能である30。しかし、従来の神経活動操作法は、脳内に光ファイバーを挿入し、オプシン発現細胞群を同時に刺激するため侵襲性が高く、時間的・空間的な精度で神経活動を操作することが不可能でした。本手法では、脳内の特定の神経細胞のみを刺激することで神経活動を操作できるため、特定の刺激パターンと高い時空間分解能で神経活動を操作することができます。さらに、ニューロン間の機能的接続は、脳スライス実験31を使用して少数のニューロンでのみ評価できることに注意することが重要です。しかし、この技術により、生きている動物の複数のニューロンを同時に評価することができます。
現在のホログラフィック顕微鏡の主な制限の1つは、マウスの頭を固定する必要があるため、マウスの動作が制限されることです。最近、小型化された2光子顕微鏡が開発され32、デバイスのさらなる小型化に伴い、ホログラフィック刺激によるin vivoCa2+イメージングが自由移動マウスで可能になる可能性があります。さらに、この顕微鏡の可能性は、イメージングの時間分解能を向上させ、それを高感度の電位感受性蛍光タンパク質と組み合わせることによって拡大することができる33。
The authors have nothing to disclose.
本研究は、科学研究費補助金 新学術領域研究(19H04753, 19H05219, 25110732 to H. W.)、科学研究費補助金 学術変革領域研究(A)(20H05899 to H. W., 20H05886 to O. M., 21H05587 to D. K.) 国際共同研究推進(B)(20KK0170 to H. W.)、科学研究費補助金 基盤研究(B)(18H02598 to H. W.) 科学研究費補助金 基盤研究(A) (21H04663 から O. M), 若手研究 (20K15193 から X. Q), JST CREST 課題 JPMJCR1755, JST A-STEP 課題番号 JPMJTR204C
25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |