우리는 비정상적인 신경 활동과 관련된 신경 정신 장애의 발병 기전을 밝히기 위해 높은 시공간 해상도를 사용하여 신경 활동을 시각화, 평가 및 조작할 수 있는 이광자 홀로그램 현미경을 개발했습니다.
광학 생체 이미징 및 광유전학의 최근 발전으로 살아있는 동물의 세포 활동을 포함한 생물학적 현상의 시각화 및 조작이 가능해졌습니다. 신경과학 분야에서는 학습, 기억 등 뇌 기능과 관련된 세밀한 신경 활동이 밝혀졌고, 이 활동을 인위적으로 조작하여 뇌 기능을 발현하는 것이 가능해졌습니다. 그러나, 이광자Ca2+ 이미징에 의한 신경 활성의 종래의 평가는 낮은 시간 해상도의 문제점을 가지고 있다. 또한, 광섬유를 통한 기존의 광유전학에 의한 신경 활동의 조작은 동일한 유전적 배경을 가진 뉴런의 활동을 동시에 조절할 수 있을 뿐이므로 개별 뉴런의 활동을 제어하기 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 최근 펨토초 적외선 레이저 빔을 수정할 수 있는 디지털 홀로그램 기술과 광유전학을 결합하여 생물학적 응용을 위한 높은 시공간 해상도를 가진 현미경을 개발했습니다. 여기에서는 샘플 준비 및 이광자 홀로그램 현미경의 작동을 포함하여 신경 활동의 시각화, 평가 및 조작을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 이러한 프로토콜은 신경 활동에 대한 정확한 시공간 정보를 제공하며, 이는 신경 활동의 이상으로 이어지는 신경 정신 장애의 발병기전을 설명하는 데 유용할 수 있습니다.
이광자Ca2+ 이미징은 신경 활동을 평가하는 데 유용한 기술입니다. 정상 동물 1,2의 행동 및 기억에 필요한 신경 활동뿐만 아니라 신경 정신 장애 3,4의 마우스 모델에서 발생하는 비정상적인 신경 활동을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 뇌 기능의 신경 기초를 밝히는 데 사용되었습니다. 그러나, 고해상도 및 고화질 이미지를 제공할 수 있지만, 그 시간적 해상도는 전기생리학적 방법(1,3)보다 낮다.
광유전학(Optogenetics)은 신경과학자들이 뇌 기능을 이해하는 방식을 혁신하는 데 도움을 주었다5. 기술적 한계를 감안할 때, 광유전학 연구의 대부분은 공간 분해능이 낮은 활성화 체계를 사용했기 때문에 그에 따라 수행할 수 있는 신경 활동의 조작 유형을 제한했습니다. 그러나 더 미세한 시공간 규모에서 신경 활동을 조작하는 것은 신경 계산과 신경 정신 장애의 발병 기전을 보다 완벽하게 이해하는 데 잠재적으로 유용할 수 있습니다. 펨토초 근적외선 레이저 빔을 형성할 수 있는 공간적으로 정밀한 홀로그램 기술은 이러한 도전을 극복할 것을 약속하고 이전에는 불가능했던 몇 가지 새로운 실험 클래스를 열어줍니다 6,7. 이 기술을 통해 신경 과학자들은 도달할 수 없는 감각, 인지 및 행동 신경 코드의 근본적인 측면과 병리를 밝힐 수 있습니다.
홀로그램 프로젝션은 개별 세포와 기능적 네트워크에 선택적으로 접근하기 위해 원하는 조명 패턴을 생성하는 것을 포함합니다. 생체 내 실험에는 살아있는 뇌의 표적 세포에 대한 최적의 광 투과가 필요합니다. 적외선은 생체 조직 깊숙이 침투하여 비선형 이광자 여기(2PE)8,9,10에 사용할 수 있습니다. 따라서 홀로그램 프로젝션과 2PE를 결합한 이광자 홀로그램 현미경은 생체 내에서 세포 및 기능 네트워크를 조사하기 위해 신경 활동을 평가하고 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 이광자 홀로그램 현미경의 최근 생물학적 응용은 시각 피질 11,12, 후각 전구13 및 해마14에서 학습에 필요한 신경 활동과 회로를 설명했습니다.
전 세계의 수많은 실험실에서 홀로그램 자극 시스템 15,16,17,18,19,20,21,22,23을 사용하여 흥미로운 결과와 개선을 보고했습니다. 여기에 설명된 시스템에서, 홀로그램 자극 시스템은 종래의 현미경을 위한 애드온 장치로서 구축될 수 있다. 위상 전용 공간 광 변조기(SLM)는 평면 파면을 모든 모양으로 변조하는 핵심 장치이며 간섭 효과는 초점의 강도와 위치를 제어하는 데 사용됩니다. 그림 2는 홀로그램 자극 및 이미징 조명 경로를 보여줍니다. 첫 번째 광 경로는 포인트 스캐닝 이미징 모드용이며 스캔 헤드와 이미지 감지기로 구성됩니다. 두 번째 광 경로는 1040nm 파장의 홀로그램 자극을 위한 것으로 SLM1로 구성됩니다. 세 번째 광 경로는 920nm 파장의 홀로그램 조명용이며 SLM2와 이미지 센서로 구성됩니다. 홀로그램 이미징 모드는 샘플의 여러 지점을 조명하여 여러 관심 영역의 강도를 기록할 수 있습니다. 이러한 방식으로 녹화 속도를 초당 수백 프레임으로 높일 수 있습니다. 포인트 스캐닝 이미징 또는 홀로그램 조명 이미징을 달성하기 위해 920nm 레이저는 3:7의 고정 비율로 빔 스플리터에 의해 두 개의 경로로 분할되었습니다. 모든 광학 요소는 600mm × 600mm 크기의 광학 브레드 보드에 정렬되었습니다. 변조된 빛은 현미경 본체 측면의 광 포트를 통해 들어갔고, 포인트 스캐닝 이미징 빛은 현미경 본체 상단의 스캔 헤드를 통해 들어갔습니다. 이 조명은 대물 렌즈 바로 위에 통합되어 샘플 평면에 초점을 만들었습니다. 또한 맞춤형 소프트웨어를 통해 일반 워크플로를 간단하고 일관되게 만들 수 있었습니다.
이 기사에서는 홀로그램 자극 또는 조명을 사용하여 신경 활동을 측정하고 뉴런 간의 기능적 연결을 평가하기 위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 시연을 위해 여기서는 마우스 뇌의 일차 체성감각 피질(S1HL)의 뒷다리 영역을 대상으로 하는 뇌 수술과 이광자 홀로그램 현미경을 사용하여 신경 활동을 평가하고 조작하는 방법을 설명합니다. 실험 절차는 네 부분으로 나뉩니다. 먼저, 머리판을 치과용 시멘트를 이용하여 마우스의 두개골에 고정하였다. 둘째, jGCaMP8f 또는 GCaMP6m-P2A-ChRmine을 발현하는 바이러스 벡터를 S1HL에 정위 주입하였다. 셋째, 홀로그램 자극 또는 조명 시스템을 보정하였다. 넷째, 수술 후 회복 및 이들 두 단백질의 발현 후, 생체 내 Ca2+ 이미징을 수행하여 이광자 홀로그램 현미경으로 뉴런 간의 신경 활성 및 기능적 연결성을 평가하였다.
뇌 기능을 이해하려면 신경 활동의 역학을 추출하여 뇌 기능의 기초가 되는 신경 회로를 정확하게 평가해야 합니다. 또한, 신경 정신 장애의 발병 기전을 밝히기 위해이 신경 회로가 어떻게 변경되는지 확인하는 것이 필수적입니다. 실제로, 알츠하이머병4 및 취약 X 증후군26 의 마우스 모델과 백질 기능이 손상된 마우스3에서 신경 활동이 증가한 것으로 알려져 있다. 또한, 염증성 통증의 마우스 모델에서, 신경 활동의 증가된 동기화와 뉴런 간의 기능적 연결성은 증상과 관련이 있다24. 이광자 홀로그램 현미경을 사용하면 신경 회로를 이해하는 데 필요한 개별 뉴런의 활동과 뉴런 간의 기능적 연결을 동시에 관찰할 수 있습니다. 우리는 1,040nm의 파장을 가진 개구수 = 1.1의 25x 대물 렌즈를 사용했습니다. 이론적 점 확산 함수는 절반 최대치에서 전폭이 측면으로 0.5μm, 축 방향으로 1.7μm인 가우스 분포입니다. 그러나 실제 개구수는 1.1 미만이고 형광 비드에서 측정된 스폿 크기는 측면으로 1.2μm, 축 방향으로 8.3μm입니다. 뉴런 직경이 약 15μm이고 보정 오차가 3μm 이내인 경우 타겟팅은 일반적으로 양호합니다. 그러나, 축 방향의 셀은 더 긴 스폿 크기(6)에 의해 영향을 받을 수 있다. 여기에서는 바이러스 주입, 수술, 홀로그램 자극 또는 조명 시스템의 보정, 현미경 시스템을 사용하여 살아있는 마우스의 신경 활동을 평가하고 조작하기 위한 이미징 프로토콜에 대해 설명했습니다.
헤드 플레이트 이식 및 바이러스 주입에서 홀로그램 현미경을 사용한 생체 내 Ca2+ 이미징을 위한 데이터 수집에 이르기까지 모든 실험 절차를 완료하는 데 2-4주가 소요됩니다. 이 과정은 복잡하고 힘들며, 실험의 궁극적인 성공 여부는 수술 후 염증의 영향을 받는 두개골 창의 상태, Ca2+ 지표 및 옵신의 적절한 선택, 획득한 이미지의 움직임 인공물을 교정할 수 있는지 여부 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 특히 성공적인 결과를 위해서는 두 단계가 중요합니다. 첫 번째는 헤드 플레이트 고정 및 수술에 관한 것입니다. 헤드 플레이트를 치과용 시멘트로 마우스 머리에 단단히 고정하는 것이 중요합니다. 또한 수술 중 차가운 ACSF를 사용하여 뼈 조각과 응고된 혈액을 반복적으로 세척하는 것이 중요합니다. 이 절차를 준수하면 염증이 감소하기 때문에 뇌의 면역 체계를 담당하는 세포 인 미세 아교 세포의 역학을 성공적으로 관찰 할 수 있었으며 그 과정과 척추 또는 뉴런의 미세 구조를 활성화하지 않았습니다27,28. 두 번째 문제는 신경 활동의 평가와 조작입니다. 우리는 하나의 뉴런에서 Ca2+ 지표와 옵신을 동시에 발현하기 위해 AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1을 선택했습니다. 이는 하나의 뉴런을 다른 AAV 유형으로 효율적으로 감염시키는 것이 어렵 기 때문입니다. 이러한 선택의 또 다른 이유는 ChRmine이 2광자 레이저(12)를 사용하여 1,040nm에서 신경 활동을 효율적으로 활성화할 수 있기 때문이다. 최근, ChRmine은 초저온 전자 현미경에 의해 얻어진 구조 정보를 기반으로 그 구조를 변이시킴으로써, 그 기능을 향상시킨다고보고되고 있습니다29, 이는 신경 과학 분야의 표적 기능 분석에 유용하다고 여겨지고 있습니다. 이러한 문제에 비추어 볼 때, 홀로그램 현미경을 사용하여 신경 활동을 읽고 정보를 쓸 때 뉴런을 평가하고 조작하는 효과적인 방법을 공유할 필요가 있습니다.
영상 및 광유전학의 최근 발전은 학습 및 기억과 같은 뇌 기능과 관련된 상세한 신경 활동을 밝혀냈으며, 이 신경 활동을 인위적으로 조작하여 뇌 기능을 표현하는 것이 가능하다30. 그러나 신경 활동을 조작하는 기존의 방법은 뇌에 광섬유를 삽입하고 옵신 발현 세포 그룹이 동시에 자극되기 때문에 시간 및 공간 정밀도로 신경 활동을 조작하는 것이 불가능하기 때문에 매우 침습적입니다. 우리의 방법은 뇌의 특정 뉴런만을 자극하여 신경 활동을 조작할 수 있으므로 특정 자극 패턴과 높은 시공간 해상도로 신경 활동을 조작할 수 있습니다. 또한, 뉴런 간의 기능적 연결성은 뇌 절편 실험31을 사용하여 소수의 뉴런에서만 평가될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이 기술을 사용하면 살아있는 동물의 여러 뉴런을 동시에 평가할 수 있습니다.
현재 홀로그램 현미경의 주요 한계 중 하나는 마우스 머리를 고정해야 하므로 마우스의 동작이 제한된다는 것입니다. 최근에는 소형화된 이광자 현미경이 개발되었으며(32), 장치의 추가 소형화에 따라 자유롭게 움직이는 마우스에서 홀로그램 자극을 통한 생체 내 Ca2+ 이미징이 가능할 수 있습니다. 또한, 이 현미경의 잠재력은 이미징의 시간적 해상도를 개선하고 이를 고감도 전압에 민감한 형광 단백질(33)과 결합시킴으로써 확장될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 혁신 분야에 대한 과학 연구를 위한 보조금(19H04753, 19H05219 및 25110732 to H. W.), 변형 연구 분야에 대한 보조금(A)(20H05899 H. W., 20H05886 O. M., 21H05587 to D. K.), 공동 국제 연구 육성(B)(20KK0170 to H. W.), 과학 연구 보조금(Grant-in-Aid for Scientific Research)(18H02598 to H. W.), 과학 연구 보조금 (A) (21H04663 to O. M.), 초기 경력 과학자 보조금 (20K15193 to X. Q.), JST CREST 보조금 번호 JPMJCR1755, 일본 및 JST A-STEP 보조금 번호 JPMJTR204C.
25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |